Biokémia

Előnézet

A jegyzetről

Biokémia segédlet: fehérjék tisztítása, elválasztása stb.

Vásárlás (500 Ft)

Név

Biokémia

Típus

Felsőoktatás

Tantárgy

Biokémia

Év

2017

Szak

Biológia

Intézmény

Szegedi Tudományegyetem

0 letöltés

Szerző

b.hanna

Létrehozva

2022-01-06

Oldalak száma

Jelentem

Biokémia segédlet, ZH 1. A centrifugálás Ha egy testet egy fonálon tartva pörgetünk, húznunk kell a fonalat ahhoz, hogy a test körpályán maradjon, megakadályozva, hogy a test egy érintő egyenes mentén, egyenes vonalú egyenletes mozgást végezzen. Az az erő, amivel a tengely felé húzzuk fonalat, a centripetális erő. Az ezzel éppen ellentétes irányú, a test tehetetlenségéből fakadó fiktív erő, amellyel a test a fonálon keresztül húzza a kezünket, a centrifugális erő. Amikor oldatokat centrifugálunk, akkor az oldatban lévő részecskék vákuum helyett egy adott sűrűségű közegben vannak, és természetesen erre a közegre is hat a centrifugális erő. Amennyiben a részecske sűrűsége éppen megegyezik a közeg sűrűségével, úgy a részecske a közeghez képes nem mozog, vagyis a sugárirányú elmozdulása nulla lesz. Ha a részecske sűrűsége nagyobb, mint a közegé, akkor sugár irányban elindul kifelé (miközben az általa kiszorított közeg a sugár felé halad), ha pedig a sűrűsége kisebb a közegénél, akkor elindul sugárirányban a tengely felé (miközben az általa kiszorított közeg kifelé halad). Differenciál centrifugálás - sejtfrakcionálás döntően részecske méret alapján Az egyes sejtalkotók sűrűsége csak kis mértékben, míg méretük nagymértékben eltér. Így, bár a fent bemutatott esetben méret és sűrűség szerint is történik elválasztás, a méret szerinti elválás dominál. A differenciál centrifugálásnak elnevezett eljárás során az egyes sejtalkotókat Svedberg értékeik szerint választjuk el egymástól, szeparálási lépésenként egyre nagyobb gyorsító potenciált alkalmazva. Egy-egy szeparálási lépésben azt használjuk ki tehát, hogy azonos gyorsító potenciálra az egyes sejtalkotók eltérő sebességgel ülepednek. Adott gyorsító potenciál esetén adott időtartam alatt egyes alkotóknak szinte száz százaléka, míg más sejtalkotóknak csak töredéke ülepedik ki A feltárt sejt homogenátumot először viszonylag alacsonynak számító, 500 g gyorsító potenciállal centrifugáljuk 10 percig. Ilyen körülmények esetén, és ilyen rövid idő alatt a centrifugacsőben csak a legnagyobb Svedberg értékű részecskék, a feltáratlan sejtek, és a sejtmagok ülepednek le. Az összes többi sejtalkotó jóval lassabban ülepedik, ezért legnagyobb hányaduk még a szuszpenzióban marad. A felülúszót áttöltjük egy másik centrifuga csőbe, és újra centrifugálunk 20 percig, de most már nagyobb sebességű centrifugában 10,000 g gyorsító potenciállal. Ilyen körülmények között, és ennyi idő alatt már kiülepednek a sejtmagnál kisebb Svedberg értékű mitokondriumok, lizoszómák és peroxiszómák, de számos komponens továbbra is a szuszpenzióban marad. A felülúszót egy újabb csőbe áttöltve ultracentrifugában folytatjuk az ülepítést, ahol 100,000 g gyorsító potenciál alkalmazásával 1 óra alatt kiülepedik az úgynevezett mikroszóma frakció. Ez döntően a sejtfeltárás során az endoplazmatikus retikulumból lefűződő 50-150 nanométer átmérőjű vezikulákat, és egyéb ebbe a mérettartományba eső sejtalkotókat tartalmazza. A szuszpenzióban jellemzően makromolekulák, és egyes szupramolekuláris komplexek maradnak. Még ennél is nagyobb, több százezer g gyorsító potenciál esetén kiülepíthetők a riboszómák, illetve a nagyméretű fehérjék is. A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Sűrűség-gradiens centrifugálás - sejtfrakcionálás részecske sűrűség alapján A fent említett eljárás során -első megközelítésben- homogén sűrűségű közegben zajlik a centrifugálás. Fontos hangsúlyozni, hogy itt a sűrűség kifejezés a tömeg per térfogat értelemben vett sűrűséget jelenti, és nem valamely nem szaknyelvi viszkozitás jellemzőt. Mielőtt a sűrűség gradiens centrifugálás elvét ismertetnénk, érdemes megemlíteni, hogy a fent tárgyalt differenciál centrifugálásnál is alkalmazhatnak változó sűrűségű közeget, de ezekben az esetekben a sűrűség gradiens alacsony mértékű, és csak arra szolgál, hogy az egymástól elváló sejtalkotók rétegei kevésbé tudjanak folyadékáramlás által összekeveredni. A sűrűség gradiens centrifugálás során a centrifugacsőben létrehoznak egy olyan közeget, amelynek a sűrűsége a centrifugacső alja felé haladva meredeken növekszik. Ezt valamilyen nagy sűrűségű anyag, például cézium klorid (CsCl) használatával érik el. A csőbe úgy töltenek CsCl tartalmú oldatot, hogy a betöltést magas CsCl koncentrációjú oldattal kezdik, de a betöltött oldat CsCl koncentrációja a betöltött térfogat függvényében egyenletesen csökken. Az így kialakított közeg tetejére rétegezik az elválasztandó részecskéket tartalmazó oldatot . A centrifugálás során a részecskék ülepedni kezdenek. A cső alja felé haladva egyre nagyobb sűrűségű közegbe kerülnek. Minden részecske csak addig ülepedhet, amíg éppen eléri azt a közeg réteget, amelynek a sűrűsége éppen megegyezik a saját sűrűségével. Ekkor a részecske nem ülepedik tovább, hiszen a lebegési faktor értéke ekkor nulla, a részecskére nem hat eredő erő. Amint elmozdulna a nála nagyobb sűrűségű közeg fel, úgy a rotor tengelye (a centrifugacső teteje) felé ható erő visszafordítaná. Amint nála alacsonyabb sűrűségű közegbe kerülne, újra ülepedni kezdene. Ez a módszer tehát kizárólag sűrűség alapján választja el egymástól a részecskéket. Egyensúlyi módszerről van szó, amelynél az elválasztás során kialakul egy állandósult állapot. (Ebben a tekintetben ez a módszer érdekes analógiája az elektroforézis fejezetben ismertetett izoelektromos fókuszálásnak (IEF), amely ugyan teljesen más fizikai paraméter, a fehérjék izoelektromos pontja szerint, de szintén egyensúlyra vezető módon választja el térben az egyes komponenseket. Az IEF módszerben is gradienst alkalmaznak a közegben, csak ott éppenséggel a közeg pH értéke változik egy gradiens mentén.) Érdemes megjegyezni, hogy a két fent említett centrifugálási eljárást, mivel azok némileg eltérő tulajdonságok szerint szeparálják az egyes részecskéket, a hatékonyabb izolálás érdekében kombinálni is lehet. Differenciál centrifugálást követően az egyes frakciókat tovább lehet komponenseikre választani sűrűség gradiens centrifugálással. A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Differenciál-centrifugálás és sűrűség-gradiens centrifugálás kombinálása. Differenciálcentrifugálásnál elsősorban méret, sűrűség-gradiens centrifugálásnál pedig kizárólag sűrűség alapján válnak el egymástól az egyes komponensek. A differenciál centrifugálás során együtt ülepedő, de sűrűségükben egymástól eltérő komponensek egy második, immár sűrűséggradiens centrifugálás során egymástól elválaszthatók. A két eljárás egymás után végrehajtva nagyobb elválasztó képességet biztosít, mint az egyes eljárások önmagukban. Fehérjék tisztítása, frakcionálása. Miután az egyes sejtalkotókat frakciónként elválasztottuk, elkezdődhet a vizsgálni kívánt fehérje tisztításának folyamata, amelynek végén a vizsgálni kívánt fehérjét homogén formában izoláljuk. A homogén formában történő előállításhoz rendszerint számos, egymást követő tisztítási lépésre van szükség. Egy korábban még nem izolált fehérje esetében próbaszerencse alapú kísérletezgetés alapján születik meg az adott fehérjére optimalizált izolálási „recept”. Az egymásra épülő tisztítási lépéseknél rendszerint a kisebb hatékonyságú, de olcsó, és nagy mintatérfogatok illetve fehérjemennyiségek kezelésére alkalmas eljárásokkal kezdünk. Ezeket durva frakcionálási módszereknek is szokták nevezni. Az ilyen, elsősorban oldhatóságon, centrifugáláson, szűrésen alapuló eljárásokkal már előtisztított mintát szokták különböző kromatográfiás módszerekkel tovább tisztítani. A durva frakcionálási módszerek elsősorban oldhatósági és méret szerinti különbségeken alapulnak. Oldhatóságon alapuló módszerek A fehérjék oldhatósága alatt azt értjük, hogy az adott fehérjéből milyen mennyiséget képes az adott oldószer egységnyi térfogata oldatban tartani. Ezt leggyakrabban mg/ml mértékegységben szokták kifejezni. Az oldhatóság nagyban függ az oldószer összetételétől. A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Mielőtt ennek a részleteit tárgyalnánk, az oldhatóság kérdésénél fontos tisztázni, hogy natív, vagy denaturált fehérjék oldásáról van-e szó. A megértést zavaró durva leegyszerűsítés az a hibás szemlélet, ami szerint a natív állapotú fehérje mindenképpen oldatban van, míg a denaturált fehérje mindenképpen kicsapódik az oldatból. Az alábbi ismertetésben elsőként a natív állapotú fehérjék oldhatóságáról lesz szó, később foglalkozunk a denaturálás témakörével is. Az oldhatóság pH-függése Leginkább az oldat pH-értéke és ionkoncentrációja befolyásolja a natív fehérje oldhatóságát. Az oldhatóság pH-függésével kapcsolatban ismert tény, hogy a fehérjék oldhatósága izoelektromos pontjuknak (IEP) megfelelő pH értéken minimális. Ez annak tulajdonítható, hogy ezen a pH értéken, a fehérjén éppen annyi negatív töltés van jelen, mint amennyi pozitív töltés. Emiatt az egyes fehérjemolekulák a lehető legkisebb mértékben taszítják egymást, miközben az azonos számú, ellentétes töltésű molekularészletek között létrejöhető intermolekuláris elektrosztatikus kölcsönhatások száma maximális. A fehérjék oldhatóságának függése a közeg pH értékétől. A fehérjék oldhatósága minimum értéket mutat a fehérjére jellemző izoelektromos pontnak megfelelő pH értéken. Ezen a kémhatáson az adott fehérjén a negatív és a pozitív töltések száma éppen megegyezik. Az elektrosztatikus vonzó kölcsönhatások lehetősége ezen a pH értéken a legnagyobb, ami aggregátumok képződéséhez vezethet. Az izoelektromos pont alatt a fehérjének nettó pozitív, a felett nettó negatív töltése van, az adott fehérje egyes molekulái tehát az izoelektromos ponttól eltérő pH értéken inkább taszítják egymást. A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Az oldhatóság függése az ionkoncentrációtól: A fehérjék oldhatósága desztillált vízben alacsonyabb, mint olyan oldószerben, amely ionokat is tartalmaz. Amennyiben egy olyan ionmentes oldathoz, amelyben oldhatóság feletti mennyiségben vannak natív fehérjék, kis koncentrációban ionokat (sót) adagolunk, azt fogjuk tapasztalni, hogy a kicsapódott natív fehérjék is oldatba kerülnek. Ezt a jelenséget „besózásnak” (angolul salting-in) nevezik (5.5. ábra). A kismennyiségben bevitt ionok tehát növelik a fehérjék oldhatóságát. Amint azt az oldhatóság pH-függésénél is láthattuk, a fehérjék oldhatóságát csökkenti, ha a fehérjemolekulák a felszínükön lévő töltéssel rendelkező csoportokon keresztül vonzó ionos kölcsönhatásokat létesíthetnek egymással. Az oldatba kerülő kisméretű ionok ellenionként működve képesek leárnyékolni a fehérjék felszínén lévő töltéseket, és ezáltal csökkenteni a fehérjék között kialakuló ionos kölcsönhatásokat. Ez magyarázza a „besózás” jelenségét. Amennyiben az ionok koncentrációját egy bizonyos – az adott fehérjére jellemző – érték fölé emeljük, a fehérje oldhatósága a növekvő ionkoncentráció függvényében csökkenni fog. A csökkenő oldhatóság miatt megfelelően magas fehérjekoncentráció esetén a natív fehérjemolekulák egy része csapadékba kerül. Ezt a jelenséget „kisózásnak” (angolul saltingout) nevezik. A jelenség oka elsősorban az, hogy az oldatba vitt ionok körül hidrátburok alakul ki. A tiszta vízben a vízmolekulák koncentrációja ~55,6 M. Amennyiben az oldott ionok koncentrációja már a mólos koncentrációtartományban van, az eredetileg szabad vízmolekuláknak tetemes része kerül az ionok körül létrejövő hidrátburokba. A vízmolekuláknak ez a hányada már nem vesz részt a fehérjemolekulák oldatban tartásában. Más szóval a fehérjemolekulákat eredetileg körülvevő hidrátburok elvékonyodik, így a fehérjék közötti apoláros kölcsönhatások felerősödnek. A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Irreverzibilis kicsapási módszerek: A globuláris fehérjék denaturálása kiváltható például magas hőmérséklet (hődenaturálás), vagy extrém pH alkalmazásával. Amennyiben az izolálandó fehérjénk valamilyen kicsapódást okozó, denaturáló hatásnak az átlagosnál jobban ellenáll, például hőstabil, vagy savtűrő, úgy ez a tulajdonsága kiaknázható az izolálás során. Megfelelően magas hőmérséklet, vagy extrém pH érték alkalmazásával a „szennyező” fehérjék jó része denaturálódott állapotban kicsapódik, centrifugálással eltávolítható, míg az izolálandó fehérjénk (rendszerint más fehérjékkel együtt) oldatban marad. Részecskeméreten alapuló módszerek Egyes durva frakcionálási eljárások részecskeméret alapján képesek egymástól elválasztani az egyes molekulákat. Az alább ismertetett két eljárás féligáteresztő membránokon alapul. Ezek a membránok olyan „sziták” amelyekben a lyukak mérete a molekuláris mérettartományba esik. A lyukak, illetve pórusok méreténél kisebb molekulákat a membrán átengedi, míg az annál nagyobbakat visszatartja. A dialízis eljárása során (lásd 2. fejezet) egy féligáteresztő membránból készült, csőalakú zacskóba töltik a mintát. Az oldatot tartalmazó „zacskót” ezután egy puffer oldatba merítik. A féligáteresztő membránon keresztül megindul mindazoknak a molekuláknak az átdiffundálása, amelyek átférnek a membrán pórusain. Ezeknek az anyagoknak a koncentrációja a membrán két oldalán kiegyenlítődik, tehát a membránnal határolt belső térben csökken. A puffer oldat keverésével az egyensúly beállásához szükséges idő lerövidíthető. A külső puffer oldatot néhányszor új oldatra cserélve könnyen elérhető, hogy a póruson átjutni képes oldott molekulákat vagy ionokat tökéletesen eltávolítsuk a dialízis zacskóból. Ezt az eljárást elsősorban arra használjuk, hogy megváltoztassuk egy fehérjeoldat ion, vagy kismolekula összetételét. Például a korábban említett ammóniumszulfátos kicsapás után a csapadékból visszaoldott fehérjék mellől dialízissel is eltávolíthatjuk a maradék ammónium és szulfát ionokat. Az ultraszűrés során is féligáteresztő membránt használunk. A dialízissel ellentétben ennél az eljárásnál valamilyen erőhatással kényszerítjük át az oldatot ezen a membránon. A víz, és a pórusoknál kisebb oldott komponensek átjutnak, míg a pórusoknál nagyobb komponensek visszatartódnak. Megfelelő méretű pórus alkalmazásával a fehérjék két frakcióra oszthatók, az egyikbe a pórusoknál kisebbek, a másikba a pórusoknál nagyobbak kerülnek. Az említett erőhatást biztosíthatja centrifugálás (Centricon csövek), vagy valamilyen nagynyomású inert gáz (Amicon berendezések). A dialízishez képest a fő különbség abban áll, hogy a pórusoknál nagyobb, visszatartott komponensekre nézve az oldat egyben töményebbé is válik. Az ultraszűrés tehát egyben koncentrálja is a visszatartott fehérjéket. A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Kromatográfiás módszerek Kromatográfia néven foglalhatjuk össze mindazokat az elválasztás technikai módszereket, amelyekben két fázis közötti megoszlás eredményeként válik szét valamilyen elegy komponenseire. A két fázis közötti anyagátadás alapulhat adszorpción, ionos kölcsönhatáson, diffúzión, oldékonyságon, affinitás-kromatográfia esetén pedig különleges, specifikus kölcsönhatásokon. Minden kromatográfiás eljárásnak közös vonása, hogy az egyik fázis folyamatosan áramlik a másik, ún. álló fázissal szemben. Az álló fázis halmazállapota lehet szilárd vagy folyadék, a mozgó fázis pedig folyadék vagy gáz. A folyadék mozgófázisú kromatográfiás módszereket a kivitelezés módjától függően feloszthatjuk oszlop és réteg kromatográfiás módszerekre. Ezek a feladat céljának megfelelően analitikai vagy preparatív méretben hajthatók végre. Gélszűréses kromatográfia Gélszűrés során a kromatográfiás oszlop töltete egy finom szemcsés, 10-300 µm átmérőjű gömbökből álló porózus, hidrofil gél. Ennek segítségével a kromatográfiás oszlopban két folyadéktér alakul ki. Az egyik a gélszemcséken kívüli szabadon mozgó mobil fázis, a másik a gélszemcsék belsejében levő korlátozott mozgású folyadéktér. Folyadék terek egy porózus gél szemcsékkel töltött kromatográfiás oszlopban. Az egyes folyadéktereket a kék területek ábrázolják. V0: kizárási térfogat; Vt: az oszlop teljes térfogata; Vt–V0: a gélszemcséken belüli folyadék és a gél anyagának együttes térfogata. Ha oldat halad keresztül egy ilyen kromatográfiás oszlopon, az oldott molekulák mozgása alapvetően két tényezőtől függ, egyrészt a mozgó folyadék fázis áramlási sebességétől, másrészt a diffúziótól, ami lehetővé teszi, hogy az oldott molekulák, ha méretük engedi, átjárják a gélszemcsék belsejét. Egy molekulakeverék szétválasztása azon alapul, hogy egy adott pórus mérettartománnyal rendelkező gél oszlop esetén egyes molekulák méretüknél fogva nem férnek be a gélszemcsék belsejébe, ezek számára csak a mobil fázis, vagyis csak a gélszemcsék közötti tér áll rendelkezésre, ezért ezek gyorsan keresztül folynak az oszlopon. A kisebb molekulák viszont méretüknek megfelelően több-kevesebb időt az álló fázis, a gélszemcsék belsejében levő folyadék térben töltenek, ezért lassabban jutnak keresztül a kromatográfiás oszlopon A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Különböző méretű molekulák áthaladása a porózus gélen .A gélszűréses (méretkizárásos) kromatográfia során a különböző méretű molekulák a diffúzió révén töltik ki a rendelkezésükre álló folyadék tereket. Az ábrán látható legnagyobb molekula méreténél fogva egyáltalán nem fér be a mátrix pórusaiba, a közepes méretű molekula bejutása csak a nagyobb pórusokra korlátozódik. (Világos szürke részek a sötétszürke mátrixban lévő pórusokat mutatják.) A legkisebb molekula minden pórusba befér. Ezért a legnagyobb molekula az oszlopon való áthaladás során, rövidebb utat megtéve egyre nagyobb előnyre tesz szert, a kisebb molekulák lemaradnak. Ioncserés kromatográfia A töltéssel rendelkező molekulák elválasztására az egyik leghatékonyabb módszer az ioncserés kromatográfia. Az ioncserés kromatográfiát leggyakrabban oszlop kromatográfia formájában hajtják végre, bár ismeretesek olyan vékony-réteg kromatográfiás módszerek is, melyek elsősorban az ioncsere elvén működnek. A továbbiakban kizárólag az oszlop kromatográfiával foglalkozunk. Az ioncserés kromatográfiához használt oszloptöltetek egy oldhatatlan hordozó (mátrix) felszínéhez kovalens kötéssel kötött töltött csoportokat tartalmaznak. A vizes oldatban szuszpendált mátrix töltött csoportjai körül az ellentétes töltésű ionok ionfelhőt képeznek. Az ionfelhőben az ionok reverzibilisen kicserélődhetnek, a mátrix jellegének és tulajdonságainak megváltoztatása nélkül. A mátrix töltött csoportjai lehetnek pozitív vagy negatív töltésűek. A pozitív töltésű mátrix az oldatból negatív töltésű ionokat, anionokat köt, ezért anioncserélőnek nevezzük. A kationcserélő mátrixok töltése negatív. Az ioncserélő mátrixok felépítése szerint megkülönböztetünk hidrofób és hidrofil mátrixú ioncserélőket. A hidrofób mátrixú ioncserélők leggyakrabban nagymértékben szubsztituált polisztirol gyanták. Szervetlen ionok megkötésére, pl. vízlágyításra kiválóan alkalmasak. Mátrixuk hidrofóbicitása és nagy felületi töltéssűrűségük miatt a fehérjéket gyakran denaturálják. A hidrofil mátrixú ioncserélőket először módosított cellulózból állították elő. A cellulóz mechanikai tulajdonságai azonban nem kedvezőek, a cellulóz szálak törnek, nehéz jó minőségű oszlopot készíteni. Ezeket a hátrányokat részben kiküszöböli a Sephadex (dextrán) alapú ioncserélő mátrix. Az utóbbi években szintetikus hidrofil polimerekből szabályos gömb alakú és monodiszperz méreteloszlású mátrixokat állítottak elő. A legismertebb ilyen anyag a Pharmacia cég által forgalmazott MonoBead alapú ioncserélő mátrix Az ioncsere elmélete A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu A legtöbb ioncserés kísérletet öt fő fázisra lehet osztani . Az első fázis az ioncserélő oszlopnak az ún. induló pufferrel történő egyensúlyba hozása, a kísérlet kezdeti körülményeinek (pH és ionerő) beállítása. Az ioncserélő töltött csoportjaihoz ebben a fázisban könnyen kicserélhető egyszerű ionok (klorid vagy nátrium) kapcsolódnak. A második fázis a minta felvitele és reverzibilis megkötése az oszlopon. Amennyiben a mintában található szennyező anyagok egy része nem kötődik az oszlophoz, ezeket az induló pufferrel történő mosással eltávolítjuk. A harmadik és negyedik fázis az elúció, a kötött molekulák deszorpciója, amit az eluáló puffer összetételének megváltoztatásával érünk el. Az elúció legegyszerűbb formája az ionerő, azaz a jelenlévő ellenionok koncentrációjának növelése. A deszorpció másik módja az eluáló puffer pH-jának változtatása. A leghatékonyabb módszer az ionerő vagy a pH folyamatos változtatása, az ún. gradiens elució. Ennek során az oszlopról először a kisebb nettó töltésű, gyengébben kötődő molekulák válnak le. Az ioncserés kromatográfia fázisai (só grádiens elúció). Az ábrán egy pozitív töltésű anion cserélő részecske látható, kiindulási állapotban ellenionokkal a felszínén. A második fázisban történik a szétválasztandó töltéssel rendelkező molekulák megkötése, a leoldás kezdetén (3. fázis), a gyengébben kötődő molekulák szorulnak le, a leoldás végén, pedig az erősebben kötődő molekulák is leválnak (4. fázis). Regenerálás során az induló pufferrel történő mosással a kiindulási állapot állítható vissza. Nagyhatékonyságú (nagynyomású) folyadékkromatográfia, HPLC A gélszűréses és az ioncserés kromatográfia tárgyalásakor már láttuk, hogy a gélmátrix szemcseméretének csökkentésével valamint a méret homogenitásának fokozásával a kromatográfia hatékonysága növekszik. A hatékonyság szinte új minőségi tartományba kerül, amikor a mátrix szemcsemérete 3-10µm méretű. Az ilyen töltetek alkalmazásával végzett folyadékkromatográfiát nevezik nagy hatékonyságú folyadék kromatográfiának, angol neve High Performance Liquid Chromatography után rövidítve HPLC-nek. Az ilyen szemcseméretű mátrixal töltött kromatográfiás oszlopok használatakor viszont a mozgó fázis (eluens) áramoltatása már csak nagy nyomású, 10 MPa körüli, speciális precíziós pumpák alkalmazásával oldható meg. A HPLC rövidítés egyidejűleg erre is ( High Pressure LC), sőt sokak szerint a speciális berendezések magas árára (High Price LC) is utal. Az alkalmazott nagy nyomás miatt az oszlop töltetével szemben elsődleges követelmény, hogy ne legyen összenyomható. Erre a célra kezdetben kizárólag, és döntően ma is szilikagélt A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu használnak, ebből ugyanis megfelelő körülmények között egyenletes és adott szemcseméretű, meghatározott pórusméretű és kellő szilárdságú gélek készíthetők. A hidrofil szilikagélhez mint állófázishoz természetesen csak hidrofób mozgófázis alkalmazható, ezért kezdetben a nagy hatékonyságú kromatográfia elsősorban hidrofób szerves oldószerekben oldódó anyagok szeparálására volt alkalmas. Később a szilikagél felszínének kémiai módosításával hidrofób felszínű szilikagéleket készítettek. Ebben az esetben az álló és mozgófázis hidrofil-hidrofób viszonya megfordul ezért ezt reverz fázisú kromatográfiának nevezték. A reverz fázisú kromatográfia megnyitotta a lehetőségét vízoldékony anyagok, így a biológiai eredetű molekulák többségének elválasztására is. Nagy pórusú gélek pedig lehetővé tették makromolekulák szeparálását is. A hidrofób felszín kialakítására hosszú alkil láncokat kapcsolnak a szilikagélre, ez lehet oktadecil, oktil, butil (C18, C8, C4 jelzéssel), de használnak fenil csoportot (lásd korábban a HIC kromatográfiánál leírtakat) vagy ioncsere céljára ioncserélő csoportokat tartalmazó géleket is. Affinitás kromatográfia Affinitás kromatográfiával nagy szelektivitással szeparálhatók biomolekulák specifikus kölcsönhatásaik alapján. Ez a szeparálási technika azért különleges, mert vagy a biomolekula biológiai funkcióján, vagy egyedi kémiai szerkezetén alapul. A technika során a biomolekula kölcsönható partnerét immobilizálják a kromatográfiás töltethez. Ez az álló fázishoz rögzített ligandum reverzibilisen megköti az akár sok komponensből álló keveréket tartalmazó mozgó fázisból a keresett biomolekulát, amit a mozgó fázis összetételének megváltoztatásával eluálhatunk az oszlopról. A technika nagy szelektivitást, nagy felbontóképességet és rendszerint nagy kapacitást biztosít a keresett fehérjére nézve. A tisztítás mértéke akár több ezerszeres is lehet és a kitermelés is általában nagyon jó. Az affinitás kromatográfia egyedülálló abból a szempontból, hogy a biomolekula egyedi biológiai funkcióján alapul. Ez a sajátossága arra is alkalmassá teszi az affinitás kromatográfiát, hogy lehetővé válik kizárólag az aktív molekulák elválasztása az inaktív denaturált formáktól is. Nagy előnye a módszernek, hogy sok esetben egy lépésben elérhető a keresett biomolekula izolálása, de azon túlmenően, hogy a szétválasztandó mintának alakos elemektől mentes tiszta oldatnak kell lennie, tanácsos a mintát valamilyen részleges szeparálással előkészíteni. Ha például vérszérumból kívánunk valamilyen igen kis mennyiségben előforduló komponenst izolálni, tanácsos a több mint 50%-ban jelenlevő szérumalbumintól valamilyen előszeparálással megszabadulni. Az elektroforézisről általában Az elektroforézis alapelve. Elektroforézis során egy-egy elektród egy-egy puffer tartályba merül. A két tartály között töltött részecskék számára átjárást biztosítunk. A két elektród között egy elektromos tápegységgel elektromos potenciálkülönbséget hozunk létre. Ennek hatására elektronok áramlanak az anód felől a katód felé. A katódról az elektronokat a pufferben lévő vízmolekulák veszik fel, hidrogén gáz és hidroxidionok keletkeznek. Az anódon vízmolekulák adnak le elektront, oxigén gáz és protonok (illetve ezek víz molekulákra kerülésével hidroxónium ionok) keletkeznek. A tartályok közötti, töltött részecskék számára átjárható összeköttetésen a pozitív ionok (kationok) a negatív katód felé, a negatív ionok (anionok) pedig a pozitív anód felé vándorolnak. A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu A gélelektroforetikus technikákról általában Az elektroforézis fent említett elve önmagában nem követeli meg, hogy annak során valamilyen gélt is alkalmazzunk. A kezdetek kezdetén nem is alkalmaztak géleket. A töltéssel rendelkező részecskéket homogén folyadékfázisban vándoroltatták. Ezzel az eljárással alapvetően három probléma adódott. Az egyik, hogy a közönséges folyadékok az eltérő méretű ionok mozgását ugyan eltérő mértékben akadályozzák, de ez az eltérés igen kismértékű, tehát az elválasztás nem hatékony. A másik fontos probléma azzal kapcsolatos, hogy egyszerű folyadékfázis esetén a folyadékfázisban akár kis hőmérsékletkülönbségek hatására is áramlások indulnak el, amelyek rontják az elválasztást. A harmadik probléma abból adódik, hogy folyadékfázisban a (minden irányban zajló) diffúzió mértéke is magas, ami szintén rontja az elválasztás hatékonyságát. Mindhárom problémára megoldást kínál a térhálós gélek alkalmazása. Az ionokat nem homogén puffer közegben vándoroltatjuk, hanem egy olyan puffer közegben, amelyet valamilyen térhálós gél „sző át”. Ez a gél megakadályozza a folyadékáramlás kialakulását, és az egyszerű folyadékfázishoz képest lényegesen nagyobb mértékben akadályozza a részecskék mozgását, ezáltal csökkenti a diffúzió mértékét. Mindezek mellett az elválasztás hatékonysága szempontjából a gél legfontosabb szerepe az, hogy a vándorló részecskék méretétől függően radikálisan eltérő mértékű akadályt jelent. Az adott térhálós gélre jellemző átlagos pórusméretnél nagyobb részecskék a gélben gyakorlatilag nem vándorolnak, azokat tehát visszatartja. A pórusméretnél jóval kisebb részecskék számára a gél „érzékelhetetlen” vagyis ezekre csak a pufferoldatra jellemző közegellenállás érvényesül. A két szélsőérték közötti részecskeméret tartományban azonban a gél erősen méretfüggő módon lassítja a részecskék vándorlását. Ebből következik, hogy egy-egy konkrét gél csak egy–egy konkrét részecskeméret tartományban használható, tehát minden konkrét feladathoz tartozik egy optimális pórusmérettel rendelkező gél. A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Izoelektromos fókuszálás Izoelektromos fókuszálás során olyan körülményeket teremtünk, hogy a fehérjék kizárólag az izoelektromos pontjuk alapján váljanak el egymástól (7.5. ábra). Az eljárás azon alapul, hogy a fehérjéken lévő, proton leadásra illetve felvételre képes csoportok disszociációs állapota függ a környezetük pH értékétől (lásd Henderson-Hasselbalch egyenlet). A fehérjék nettó töltése tehát függ a közeg pH értékétől. Amennyiben egy fehérjén a savas oldalláncok (Asp, Glu) száma meghaladja a bázikus (Arg, Lys, His) oldalláncok számát, úgy a fehérje semleges közegben negatív töltésű lesz, izoelektromos pontja (IEP), vagyis az a pH érték, amelyen a fehérje eredő töltése nulla, a savas tartományba esik. Az ilyen fehérjéket savas fehérjéknek is nevezzük. Amikor a fehérje bázikus oldalláncainak a száma múlja felül a savas oldalláncok számát, akkor semleges közegben a fehérje pozitív töltésű lesz, izoelektromos pontja a bázikus pH tartományba esik. Ezeket a fehérjéket bázikus fehérjéknek is szokták nevezni. Izoelektromos fókuszálás. Izoelektromos fókuszálás során a (rendszerint poliakrilamid) gélben pH gradienst hoznak létre. Ebben a gradiensben minden fehérje abban térrészben halmozódik fel, ahol a pH értéke megegyezik a fehérje izoelektromos pontjával. Mivel a fehérjén ekkor a negatív és a pozitív töltések száma éppen megegyezik, a fehérjére nem hat eredő elektromos erő. Mivel az eltérő fehérjék IEP értéke igen széles tartományt fed le, ezért az izoelektromos pont alapján történő elválasztás hatékony módszer. Ha a közeg pH értéke alacsonyabb, mint a fehérje IEP értéke, akkor a fehérje pozitív töltésű lesz, és elektroforézis során a katód felé vándorol. Ha a közeg pH értéke magasabb, mint a fehérje IEP értéke, akkor a fehérje töltése természetesen negatív lesz, és a fehérje az anód felé vándorol. Ha a pH értéke éppen megegyezik a fehérje IEP értékével, akkor a fehérje nettó töltése nulla, ezért elektroforézis során nem vándorol. Amennyiben olyan közegbe helyezzük a fehérjét, amelyben a pH a katód és az anód között fokozatosan (gradiens mentén) változik, úgy a fehérje elindul a vele ellentétes töltésű pólus felé. A pozitív töltésű anódnál alacsony pH értékű közeget, a negatív töltésű katódnál magas pH értékű közeget hoznak létre. Miközben a fehérje a változó pH értékű közegben vándorol, a töltése is változni fog. Ha negatív töltésűként az anód felé vándorol, úgy az egyre savasabb közegben egyre több protont vesz fel egészen addig, míg a rajta lévő negatív és pozitív töltések száma megegyezik, vagyis eléri az izoelektromos pontját. Ekkor a fehérjére nem hat eredő elektromos erő, ezért nem vándorol tovább. Ha a spontán diffúzió miatt mégis közelebb kerül az anódhoz, akkor újabb protonok felvétele miatt pozitív töltésűvé válik, és visszafelé vándorol a katód felé. Ugyanilyen gondolat mentén, ha az adott fehérje pozitív töltésűként a katód felé vándorolt, akkor az egyre magasabb pH értékű tartományon át haladva fokozatosan protonokat ad le, míg eléri izoelektromos pontját, és megáll. Ha diffúzióval közelebb kerül a katódhoz, akkor protonokat ad le, és az elektromos erő újra az anód felé vándoroltatja. Tehát a fehérjék mindegyike a saját IEP értékének megfelelő pH értékű gél-tartományba A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu fókuszálódik, a fehérjék IEP értékük alapján válnak el egymástól. A fenti folyamatok logikájából következik, hogy érdektelen, hogy a fehérjét a gél mely pontján visszük a rendszerbe, ettől függetlenül „megtalálja” az IEP értékének megfelelő pontot. A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu