Biotechnológia I.

Előnézet

A jegyzetről

Biotechnológia I. zh-hoz kidolgozott jegyzet, tételek

Vásárlás (500 Ft)

Név

Biotechnológia I.

Típus

Felsőoktatás

Tantárgy

Biotechnológia

Év

2015

Szak

Biológia

Intézmény

Szegedi Tudományegyetem

0 letöltés

Szerző

b.hanna

Létrehozva

2022-01-04

Oldalak száma

Jelentem

1. Metanogének és biotechnológiai hasznosításaik. 1. Metanogének: • Először Volta 1776-ban fedezte fel, egy hajókázás alkalmával a metánt. Mocsárgáz elnevezés tőle származik, ami áll metán és szén-dioxidből. A mocsárgáz kékes fénnyel ég. Tiszta tenyészet 1947-ben: Methanosarcina sp., Metanococcus jannaschsii 1996: első szekvenálás, mélytengeri mikroba és hipertermofil, egyik legegyszerűbb genom • Obligát anaerobok, kevés helyen fordul el, kevés helyen érzik jól magukat, előfordulnak a bálnák szájában és kérődzők gyomrában, valamint termeszek gigájában • fogyasztanak: illékony szerves savakat és H2-t használnak redukálószerként és metán és széndioxidot termelnek. • Előrodulásuk: Anareob környezetben, mélytengeri „fekete kéményekben”. • A fekete kémények: A Föld szilárd kérgének lemezei távolodnak és közelednek egymáshoz , ezen mozgások során alakulnak ki vízalatti vulkánok kürtői, a kisebbeket nevezzük fekete kéményeknek. Kb. 2000-3000 méter mélyen vannak. A víz a kürtő körül közvetlenül 1200 C°, kicsit távolabb már alig 2 C°-os. • Archeák: a legősibb életforma, Keverednek a pro- és eukarióta tulajdonságok. Antibiotikumokkal szemben nem érzékenyek. Magas hőt, pH-t, és sótartalmat is elviselnek. Felépítésük: • Sejtfal: Murein (peptidoglükán) nincs, pszeudomurein, ami eltér a valódi baktériumok sejtfalától. N-acetil-muraminsav helyett N-acetil-tallózaminuronsavat tartalmaz. • Sejtmembrán: Zsírsav észterek helyett diéterek, tetraéterek, lipid kettős membrán, éterkötések az egész membránon keresztül, • Koenzimek F42o – riboflavin, F43o – Ni-tetrapirol, Metanofurán, Nincs NAD, FAD koenzim • Tenyésztés:Obligát anaerobok ,Kemolitotrófok, heterotrófok, Ni2+ kell, cukor nem, 15-11o °C • Energia nyerés O2 nélkül Kén oxidálók CO2 + H2S → S2 + CH2O + H2O Metanogének CH3COOH → CH4 + CO2 Hidrogenotróf metanogének CO2 + 4H2 → CH4 + 2H2O Co2 redukálják metánná o Molekuláris biológia (≈ eukarióta)Policisztronos transzkripció, Start/stop: AT gazdag, TATA box: -25 bp, DNS polimeráz, RNS polimeráz: ≈ eukarióta, Riboszóma: 3oS+5oS=7oS ≈ eukarióta o Első genom szekvencia (1996)Methanococcus jannaschii (1,5 Mbp) 2. Biotechnológia: Mezőgazdasági hulladékok, Szennyvíziszap, Kommunális hulladék, Energianövény Biogáz:(Tehén: 2oo liter/nap, Ember: 2-3 liter/nap):Szerves anyag lebontás anaerob módon érdemesebb : szerves anyag cuccból levegő mellett komposztálással a kémiai energia fele,amit vissza tududnk nyerni és ez hő formájába keletkezik ami nehezen tárolható, míg anaerob módon 90% amit visszatudunk nyeri és ez metán és szén dioxid keveréke Polimerek bontása, ekkor cellulóz, keményítő, fehérjék, zsírok keletkeznek. Ezt követi a monomerek, oligomerek bontása. Ekkor cukrok, aminosavak, zsírsavak keletkeznek. Következő lépés során acetogén mikroorganizmusok hidrogént és illékony zsírsavakat állítanak elő. Végül metanogének: metán és szén-dioxid keletkezik. Metanogenézis folyamata ez. A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 2. Metilotrófok és biotechnológiai hasznosításaik. • • • • • • • Igazi eukarióták, aerob, zömmel G negatív, Sokfélék. Vékony sejtfal. esznek, és szén forrásként és energiaforrásként a metánt eloxidálják szén dioxiddá. Élőhely: aerob és anaerob határon, mert olyan környezet kell ahol metán és oxigén kell, de a metán anaerob. 3 csoport. -fakultatív metilotróf (C1-C3, esetleg hosszabbat)legnagyobb csoport, obligát C3nál (hosszabat nem eszik), metanotróf (csak CH4-t eszik). MMO-uk van, metánra egy oxigént tesz. (egyedülálló). Metanotrófok: Azok a baktériumok, amelyek CH4-et használnak szén- és energiaforrásként ezt csak ők tudják a világon.. Energiáját a metán oxidációjából nyeri: CH4 → alkohol → aldehid→sav → CO2 Kulcsenzim: Metán monooxigenáz. Metánba egy oxigént atomot beépít be= metanol képződik és a másik oxigén atomből egy redukált koenzim segítségével vízzet képez. Metanotróf anyagcserét végző mikroorganizmusokban található. Metán oxidációját dioxigénnel metanollá. Két fajtája van:szolubilis (sMMO), membrán kötött (pMMO). Az aktív centrumukban különböznek. Vastartalmú citoplazmatikus sMMO: sok szubsztrátot képes átalakítani, kofermentációval. Szubsztrátjai lehet: toluol, vinil klorid, benzol, klórmetán. A másik pMMO: réztartalmú membránhoz kötött csak CH4 a szubsztrátja. Mindkettő a ugyanazt a reakciót katalizálja. A réz ion mennyiségétől függ, hogy melyik MMO-t termel a metanotróf. Ha kevés réz ion van jelen, akkor sMMO. Ha sok réz ion van jelen akkor pMMO Metanotróf: oxidációs lépések o Metanol oxidáció ▪ MeOH dehidrogenáz (pirolloquinolin quinon) ▪ Alkohol dehidrogenáz (NADPH+, Zn2+, Mg2+) o Formaldehid oxidáció ▪ Elágazás biomassza termeléshez: Szerin vagy ribulóz-P útvonalon o Hangyasav oxidáció ▪ NAD dehidrogenáz (koenzim regenerálás) Biotechnológia alkalmazás: • Bioremediáció: biológiai uton gyógyítjuk a környezetet – Halogénezett veszélyes szennyeződések – Kofermentációval • Szerves anyagok termeltetése Egyszerű szubsztrát pl amminosavak = olcsó, szelekciós nyomás jelent és ha csak metán van a környezetben tápanyagként akkor más bacik nem élik túl Aminosavak, single cell protein: Nagy mennyiségű metilotróf fehérjekivonat. Élelmiszerhiány megoldására irányult kísérlet. Rossz kampány miatt a halliszt és a szójaliszt lekörözte. állati eledelbe, takarmányba használják (lazachús színezésre is jó). Pl: metanotrófok is ilyenek, s ebből gyártanak egysejtfehérjét. Humán táplálékanyagként nem terjedt el, de állatok tápjába keverik bele. Metanotrófok azért is jók, mert színes karotinszármazékokat tartalmaznak – Metanol: vegyipari metanol szintézise: metán+víz=zárt tartályban 1-25 atm nyomás alatt, 700-900 celsius fokon melegítés hatására=szén-dioxid+hidrogén=230-280 celsius fokon 50-100 atm nyomáson CH3OH keletkezik • Alternatív változat: zárt tartályban metanogén baktérium segítségével 1atm nyomáson 25-70 celsius fokon metán +hidrogén+oxigén hozzáadásával és végül CH3OH és víz keletkezik A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 3. Clostridia és biotechnológiai hasznosításaik. Obligát anaerobok, változatos anyagcsere jellemzi. Hőstabil endospórája van. Rossz körülmények között képezi, ez egy túlélő képlet, átmentik a genetikai anyagukat, majd megfelelő környezetben kihajt a spórából a clostridium, Gramm festés során kékre festődnek. • Gramm +→ nagyon vastag sejtfaluk van, peptidoglükán védi őket, ez egy külső váz. • Tenyésztés: A környezetükben alacsony redoxpotenciált kívánnak. Obligát anaerob környezet. Oxigén gyökök ellen szuperoxid dizmutáz termelése. Eh ≈ -150 - -450 mV • Oxigén eltávolítás: Edényekbe tenyésztik őket és manapság kémiai úton távolítják el a rendszerből, a tasak tetején található egy katalizátor amivel elreagál az oxigén. Régen pedig zárt üvegbe tették. Ég egy gyertya, ami elhasználja az oxigént. Enzimekkel, enzimatikus úton kataláz, SOD (szupero oxid dizmutázzal), de ezekkel csak kis mennyiséget lehet eltávolítani. • Poliszacharidokat, cellulóz, lignocellulóz, keményítőt is tud bontani, nagyon szeretik a cukrot. A celluloszóma és amiláz segítségével bontja. létrejönnek lábacskaszerű képződmények, ezek tapadnak rá a cellulózra. Baci felszínén kitüremkedéssel jelenik meg a cellulószóma, a nyúlványaiban enzimek illetve horgonyzó fehérjék és ezzek segítségével tapadnak a cellulózra és a felszabaduló cukrot azonnal fel tudja venni a lábacskákon keresztül.. • A clostridium anyagcsere termékei: Az anyagcsere során az eltérő redoxpotenciál aránya meghatározó. Anaerob fermentáció során eszi meg a cukrot. Potenciális anyagcsere végtermékek keletkeznek: zömmel szerves savak, kevesebb szerves oldószer, különböző gázok: szén-dioxid, hidrogén. Szolventogenezis: szerves savtermelés (kényszerítve van rá, hogy ezt termelje) az acetogenezis: oldószertermelés (normál fermentáció) • botulin toxin: Fehérje természetű toxin. 2 polipeptid láncból áll. Egyik alfa helixet tartalmaz, egy diszulfid híd kapcsolja a másikhoz, ami egy cink peptidáz. Az izmokban az ideg izom áttevődésnél a fehérjéket, szinapszisokat bontja. Az acetilkolin felszabadulását gátolja. Az izomzat nem tud összehúzódni. Hatása lassan múlik. Kis mennyiségben is mérgezést okoz. Alacsony pH-n vagy magas hőmérsékleten könnyen inaktiválódik. - biofegyverként is használták, terápiás alkalmazása ismert a botulin toxinnak: ránctalanítás (botox injekció) • botulinizmus: A legveszélyesebb ételmérgezést a Clostridium botulinum okozza, amely légzésbénulással is járhat, így potenciálisan halálos. Idegrángással lehet diagnosztizálni. a botulin mérgezés gyakori forrása: Kolbász, sonka, méz • a tetanospazmin: Clostridium tetani által termelt proteolitikus toxin. Mozgató idegvégződésekben a neurotranszmittereket gátolja. GABA gátló. Paralízist okoz. Tetanusz mérgezés jellegzetes tünetei: Az izmok görcsösen összehúzódnak és nem tudnak elernyedni. Érzékszervek nem sérülnek. Tetániás görcs. • C. acetobutilicum: Szerves oldószergyártás • C. botulinum, C. tetanus: Neurotoxin • C. histolyticum, C. perfingens: Gáz gangréna • C. thermoaceticum: Ecetsavgyártás Biotechnológiai alkalmazás: ezen kívül • Kis molekulák létrehozása – butanol, etanol, i-propanol: Pasteur (1861-ben) → butanol fermentáció, Weizmann ill. Fernbach → C. acetobutilicum (1910) A Clostridium acetobutilicum mikrobát Weizmann szerves oldószertermelésre akarta használni. Zárt rendszerben a szerves savak felhalmozódnak. Ha lecsökkentik a pH-t, akkor a Clostridium bespórázódik. Azonban ha ezt el akarjuk kerülni, akkor a pH-t kontrollálni kell és nem mehet pH 4 alá. Ha a pH 6-7 között van, akkor acetogenezis folyik. Ha viszont a pH-t 4,5 és 5,5 között tartjuk, akkor acetont és butanolt lehet velük termeltetni. Vashiányos állapotot kell létrehozni, mivel a piruvátferredoxin-oxidoreduktáz enzim nem működik. A piruvát elágazást takar, az anyagcsere út ugyanis itt ágazik el az acetogenezis és a szolventogenezis felé. [FeFe] hidrogenáz se működik – úgy szabadul meg a redukáló erőtől, hogy szerves savakat termel. – Hátrány a kis molekulák termelésének:Kevert termékek, Oldószer tolerancia • A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu – Biobutanol : Jobb, mint bioEtOH: Energiatartalom, Vízmegkötés, Szállítás, párolgás Ca-Mg-acetát = zöld só: Télen az utak sózására használják. Azért zöld, mert tavasszal lefolyik az acetát a talajba az ott lévő baktériumok megeszik. Alacsonyabb hőmérsékleten fagy meg mint a NaCl, és kevésbé rozsdásítja pl.: a hidakat, de legalább ötször többe kerül, mint a NaCl. Enzim gyártás:Amiláz, celluláz – Bioenergia:H2 + CO2, biogáz, biobutanol 4. Tejsav baktériumok és biotechnológiai hasznosításaik. Gramm pozitív, Anaerob, Nincs spóra így rossz körülmény esetén elpusztul, Sokféle környezetben előfordul • Antibiotikumot termelnek, ami gyulladások kezelésére segítség – régen ezért használták a gyulladásokra az aludttejes kezelést • A fermentálás során a fő termék a tejsav: eltávolítják a szervezetükből, mert levisz a pHjukat így aktív transzporttal vezetik ki a szervezetükből, és visszaáll pHjuk 2-2,5-re • Két csoport: homo és heterofermentatívak: Homo: csak tejsav keletkezik. Hetero: más anyagok is keletkeznek a tejsav mellett képes ecetsavat és alkoholt gyártani Biotechnológia • Molekuláris biológia: Plazmidok, Génbeviteli eljárások (konjugáció, transzdukció, protoplaszt fúzió, elektroporálás) megoldottak, Teljes genom szekvenciák, Genetikailag módosított LAB-ok • A probiotikumok élõ mikroorganizmusok, Lactobacillus bifidus. A probiotikus baktériumok által termelt tejsav csökkenti a colon pH-értékét, ezáltal gátolja a különbözõ esetlegesen vagy szükségszerûen megjelenõ anaerob baktériumok növekedését, mely toxintermelõk esetén lehetõséget nyújt arra, hogy a toxintermelés beindulásához szükséges mennyiségre a pathogen ne tudjon feldúsulni. • Fermentációjuk anaerob, Anyagcsere: homo- és heterofermentatív: Zamatanyagok • Bakteriocin: Baktériumok által termelt antibakteriális szer, akadályozza a G+ baktériumok növekedését. A bakteriocin nem enterális baktériumok által termelt kolicin szerű anyag. A nizin egy bakteriocin, melyet a Lactococcus lactis tejsavbaktérium termel, és amely elpusztíthatja a Gram(+) baktériumokat oly módon, hogy pórusokat hoz létre a citoplazma membránban. Azonban a Gram(-) baktériumokat nem érinti, mivel azok extra külső membránja a nizin számára áthatolhatatlan. Ez a korlátozás azt jelenti, hogy a nizin nem gátol olyan fontos patogéneket, mint az Escherichia coli, a Salmonella, a Campylobacter és a Yersinia, azonban inaktiválja a Bacillust, a Clostridiumot és a Listeriát • Oxigén detoxifikálás: széles választék • Silózás: Zöld takarmány tartósítás, anaerob környezetben a tejsav bacik elszaporodnak és leviszik a ph-t és a többi baci elpusztul savanykást ízt ad neki, ezt szeretik az állatok • Biogáz termelés • Élelmiszer tartósítás: Pickling: LAB + Só , Hal, zöldségek – kimchi( korei nemzeti étel, savanykás ízű), Tojás, kígyó, néha chilit is adnak hozzá • Élelmiszer tartósítás: o Kancatejből még a mongoloknál csinálják: kumisz –tápanyagban és zsírban gazdagok, élesztős és tejsavas fermentálás terméke pár napig eláll, alacsony ph-n a fehérjék kicsapódnak ezért csomós állag, élesztő miatt 2-3% alkohol tartalom o Tehén-, juh-, kecsketejből, joghurt, kefír, sajtok- tejsavas erjedéssel készülnek o Növényi alapanyagokból, Szójaszósz, Savanyú káposzta, Kovászos uborka • A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 5. Bacillusok és biotechnológiai hasznosításaik. Aerob, Endospórás, Gram +, Változatos környezetben (Talaj, Növény, Állat, Ember) és alkalmazkodni tudnak a környezethez transzportrendszerükkel, Főzött ételben is • Extremofilek: Hő, pH – toleránsak pl. pH. 10 fölött is megélnek, Aktív transzport rendszerekkel biztosítják belső neutrális környezetüket. Ionokat, protonokat pumpál egyik oldalról a másikra (vegyületeket is), változatos anyagcsere, fejlett transzport rendszerekkel a belső részükből a felesleges anyagot kitakarítják, egyébként számukra kellemes pH a 7,5 • Celluláz enzimeket csak kilőkik a szervezetükből és az megkeresi a cellulóz nem olyan hatékony, mint a cellulószóma ezért keresni kell még utána a lebontótt cukor molekulákat. • Bacillus licheniformis:Talajban található,masszív enzimeket gyárt: Alkalofil proteáz(Mosószerekben, Keratin bontás), antibiotikumokat termelnek és ezzel próbálják elküldeni a többi bacit a kajájuktól o Bacitracin antibiotikum: Egy fehérje természetű, más prokariótára mérgező anyag. Gyűrűs polipeptid viszonylag gyorsan lebomlik magas hőmérsékleten. • Bacillus thuringiensis o Delta endotoxin (Spórájában tud tárolni, Kristályos fehérje, Fajspecifikus , Biológiai rovarirtó (szúnyog, légy, molyok, Magyarországon nem használható és még az alaptörvényben is benne van, hogy nem használható a GMO-k. Sokat szokták a delta endotoxin génjének bevitele a kukoricába és ezáltal a kukorica bogár nem táplálkozik a növény szárából és gökeréből o Rezisztens törzsek, Fehérjetermészetű toxin. A rovarok lárváinak bekerül a szervezetébe, a nyálmirigyébe. Fajspecifikusan történik. Konformációváltozást idéz elő, ioncsatornát kinyitja. A folyadék kifolyik a sejtből, nem lesz a lárvának nyála, nem tud emészteni a lárva és éhen hal, Katica bogár lárváiban nem tesz kárt. A kristályos fehérje lárváiban található enzimmel tud kölcsönhatni ezáltal jön létre kölcsönhatás. Több 100 törzse van • Bacillus anthracis: Lépfene kórokozója, Emberben atipikus tüdőgyulladás, Spóra a legellenállóbb o Pánspermia elmélet: Az élet a Földre a világűrből érkezett. Ennek bizonyítéka a Bacillus antracis spórája, mivel képes megélni a világűrben. A gond csak az, hogy az űrben nem képes fényéveket utazni. o Bioterrorizmus • Bacillus natto: Rizsszalmán érlelt szójabab, Fehérjében, vitaminban gazdag = probiotikum, különleges illat, 10 000 tonna/év Bacillus biotechnológia • Szárított, fagyasztott élelmiszereken tartosítás, Fermentált élelmiszereken • Gyógyászat: Patogének, o Ciklodextrin gyógyászatban: a gyógyszerek targetálására használják. Cukormolekulákból áll, gyűrűs szerkezetű. A külseje hidrofil, a belseje hidrofób. De fordított is lehet. Molekuláris edényke csinálható belőle. Sok olyan gyógyszer van ami hidrofób. Ha becsomagoljuk a gyógyszert ciklodextrinbe, akkor az előbb-utóbb lebomlik. • Mivel extremofilok ezért olyan enzimek amelyik bírják az extrém körülményeket: Enzimek Proteázok, lipázok Celluláz, amiláz –zöld mosószerekben található, kevesebb detergens kell beletenni o Stone washed: A celluláz, amiláz exoenzimeket használják. Nem tapad rá a bacillusra, elharapdálják a cellulóz szálakat, majd ezután kapkodja össze a bacillus. Régen horzsakővel mosták együtt a farmert. Megtöredezik a cellulóz szálakat és p puhább lesz a farmer. Ezt váltják ki a bacillus cellulóz kezeléssel • B. subtilis – EtOH gyártáshoz, cukor bontó polimerek miatt • A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 6. Pseudomonasok és biotechnológiai hasznosításaik. Aerob, Gram –, Heterotróf, Változatos anyagcsere: Exopoliszacharidok, Exoenzimek Poláris flagellum: és ezt felkeltette a nanotechnológia érdeklődését. Energia, amit használ: Proton gradiens hajtja, Gepárd (25 testhossz/s, 110 km/óra) Baci: 50-60 testhossz/s • Kommunikáció, kapcsolat a külvilággal: o Sziderofórok: Pseudomonasok akkor termeli, amikor kevés a szervezetében az ion. Komplikált felépítésű vegyületek, fémionokat tudnak megkötni, és a Pseudomonasok ezeket együtt veszik fel. ▪ Quorum sensing: Térbeli rendezettség. A mikróbák kommunikációjának módja szondákkal. Érzékelő, kémiai jelmolekulákat bocsátanak ki, s a többiek ezt érzékelni tudják, s jelként fogják. Reagálnak rá. Fajspecifikus kémiai kommunikáció. • Ha kevés van, akkor a jelzőmolekulák kihígulnak, ha sokan vannak, akkor megkapják a jelet, és viselkedésük megváltozik. Különböző anyagokat kezdenek gyártani szaporodás helyett. o Sejt koncentráció függő változások, ami válasz a kommunikációra ▪ Anyagcsere, génexpresszió, környezetre reagálás, viselkedés. ▪ Rhamnolipidek: Felületaktív vegyületek: Hidrofób szubsztrátok oldatba vitelére jó, pl. olajok, nyúlványos anyagok, amelyeket kibocsájtanak, és ebbe beleragadnak és működésük hatékonyabb – pl biofilm esetén o Biolumineszcencia: Speciális szervekben felhalmozott szimbionta baktériumok: Világítás, préda csapda • Pseudomonas aeruginosa ▪ Gyulladás, folliculitis:Biofilmet képez. Tüdőgyulladást, felületi gyulladást okoz. Alginátot (poliszacharid) gyárt, ami bevonja a felületet. Tüdőben légzési nehézséget okoz, csökkenti a légzőfelületet. Legyengült szervezetben gennyes sebet hoz létre, szőrtüszőkre terjed, nehezen gyógyuló csúnya gyulladás. ▪ Opportunista patogén: legyengült szervezetekben súlyos, Állatokat is betegít, sok flagellum,Piocianin fluoreszkáló festék: diagnosztikus, exopigment, kibocsájtja, Szénhidrogéneket bont aerob, fakultatív anaerob környezetben o Nehéz antibiotikummal ki írtani • Pseudomonas fluorescens o Több flagellum, Nagyon változatos anyagcsere o Biokontroll faj, Fuzárium, fluoreszkál o Növényevő nematódák, Mechanizmus nem ismert, de hatékony, o Bioremediáció: Veszélyes vegyületek: Aromás gyűrű, Toluol , Poliaromás szénhidrogének, Poliklórozott bifenilek, Oldalláncok, karcinogéneket is bont o Pseudomonas syringae, növényi patogén ▪ “Ice protein” – extracelluláris fehérje, Jégkristály képződést elősegítő góc , olyan hőmérsékleten ahol hideg van, de még nem fagyna meg a víz, jégkristályok növekednek (olyan 0 fok körül). Növény felületén él, s kiszúrja a növény levelét, s a sejt tápanyagait eszi meg. Növényeken barnás elszíneződést okoz. Ezért a jégeső elleni küzdelemben használják fel. Úgy hogy fellövik, ahol ezek a jégképző anyagok, jégkristályok képződését idézik elő. Hó lesz a jég helyett. A lehulló fehérje, s nem okoz kárt a földben, hasznosítják a talajlakó baktériumok. ▪ Jégeső elleni küzdelem, Halogén (jodid, bromid) sók, P.s. fehérje, Gócképző a felhőben is • • • A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Pseudomonasok biotechnológiai hasznosításai. Enzimek: proteázok, lipázok, hidroxilázok. Biokontroll (gombák ellen növényvédő, férgek ellen), Bioremediáció (toluol, PAH, PCB). Jégeső védelem 7. Fototróf mikroorganizmusok és biotechnológiai hasznosításaik Ősi baktériumok, evolució elején kialakultak fotoszintetizálnak, fény energia segítségével szervetlen agyagokból állítják elő saját szerves anyagaikat vagy fény energia segítségével szerves anyagok bontásából állítanak elő szenet. • Igénytelen csak fény kell neki és extrém körülmények között is megél. Nem bontják a vizet, igénytelenek. Fotoszintézis két stratégiája van a vízbontás, mint a zöld növényekben, és amikor nem tud vizet bontani • Fotoszintézis bonyolult folyamat, ahol pigment rendszereken keresztül sorra gerjesztett állapotba kerülnek az elektronok, amelyeket pumpál a fény a rendszerbe. Fókuszálja egy reakciócentrumba, ahol membránfolyamatok eredményeképpen nagy energiájú elektron formájában az első lépésben majd a második lépésben kémiai kötés formájában nyerik az élőlény az energiát. Vagy egy fotonos reakció, amikor redukált vegyületekkel kel etetni a rendszer. A két fotonos reakció a második foton már olyan nagy energiája van az elektronok, hogy ATP formájában tudja hasznosítani. • Cianobaktériumok: fejlettebben, z sémás fotoszintézist végzik, légköri nitrogént el tudják redukálni nitrogenáz enzimkomplexükkel,. Ez a két folyamat térben el van választva, a heterociszták biztosítják az anaerob környezetet. • Kedvező környezetben domináns populációk – Magas hőmérséklet, Extrém pH, Extrém tápanyag ellátás – Nitrogén fixálás, Heterocisztával végzik, nitrogenáz van benne, összetett enzimkomplex, a levegő N-jét N forrásként tudja használni, és a N-t ammóniává redukálja. – heterociszta: Cianobaktériumokban van. Anaerob környezetet biztosít, ami mellett vízbontás is történik a baktériumban. Található a nitrogenáz enzim, ami a levegő N-t N forrásként tudja használni, és ammóniává redukálja. – Biomassza termelés, Bioremediáció, hidrogén elállításában – Napenergia konverzió, Biodiverzitás, Megújuló energia termelés – Vegyipari alapanyagok, pl. glicerin, Bioaktív anyagok: “kék” biotechnológia, Karotinok, enzimek – Szennyvízkezelés, tisztítás: Oldott szerves anyagot felveszi, metabolizálja és elengedi CO2 formában. Először kiszűrik a nagyobb dolgokat, koszos lé marad ezt medencékbe vezetik és aerob módon tisztítják . levegőztetik és bacik elszaporodnak az iszapban és bontják a szerves anyagot. Majd a bacikat elválasztják a víztől és anaerob módon fermentálják. A biomasszát anaerob módon energiát termelnek Winosgrad (híres mikrobiológus)- tisztítási eljárás szennyvízkezelés, baktériumok segítségével, • 8. Sugárgombák és biotechnológiai hasznosításaik • • • Más néven streptomycek. Jól differenciálódnak és mikroszkóp alatt fonalak képződések láthatók innen a név, de ők bacik Baktérium, de különböző sejtformákkal, Geozmin – földszag nyári zápor után a szagot az erdőkben, élnek, szimbiózisban élnek a növényekkel Mikorrhiza: Endo, Ekto, . A sugárgomba szénhidrátokat kap, a növény a megnövekedett felület miatt több vizet és ásványi sót kap cserébe. o Típusai: endomikorrhiza (benne van a növényi sejtben a hifa fonal), vagy ▪ ektomikorhizza, ekkor a növényi sejtek között vannak a hifa fonalak. A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu • • • • Másodlagos anyagcsere termékek = bioaktív anyagok, antibiotikumokat képesek gyártani pl. streptomicin. Heterológ expresszió: helyes protein folding Mikorrhiza = szimbiotikus együttélés (Orchideák, Gabonafélék, Eukaliptusz, Fenyő) Sreptomycesek biotechnológiai hasznosításai. Patogén mikrobából készítenek pázsitot, itt a baktericid anyagot termelő gomba köröket képez vizsgáljuk- antibiotikum rezisztencia vizsgálat. Heterológ expresszió: lehet bennük más élőlény fehérjéjét termeltetni. 9. Élesztők és biotechnológiai hasznosításaik. Élesztő – Sacharomyces cerevisiae •Eukarióta, “Ember rokona”, mert nagyban hasonlít a posztranszlációs módosításaik, ezért jól használható humán terápiás fehérje termelésre •Differenciálódott, teljes Sejtciklus jellemzi, Spóra •glikolízis a citoplazmában •légzés a mitochondriumban •zsírnyagcsere a peroxiszómában •proteolízis a vacuolumban •kromoszómák a nucleusban •Élesztő lehet haploid vagy diploid – Haploid/Diploid sejt – mitozissal szaporodik – Diploid sejt stressz alatt meiozissel haploid spórákat gyárt – Haploid “mating” Az élesztők alfa feromonkat bocsájtanak ki, a különböző szexualitásúak fölismerik egymást, összeolvadnak, diploid lesz. A feromonok váltják ki ezt a szaporodást. – “a” és “α” a legegyszerűbb szexuális szaporodási modell – “Mating factor” = feromonok – Diploid sejt fennmaradhat, mitozissal szaporodhat •Raktározás –Glikogén: Tipikus eukaryota raktározott tápanyag –Trehalóz: Diszacharid, Vízmegkötő – kozmetikumokban, Nem nagyon édes édesítőszer, Tartósít – nem tudjuk hogyan •Sejtfal: Kitin alapváz + glükánok (1,3 vagy 1,6), Glükoproteinek, Mannoproteinek •“budding yeast”- sarjadzás, S. cerevisiae •“fission yeast” hasadás, kettéválás, Schizosaccharomyces pombe Élesztő – biotechnológia •Gyógyszeripar, Hepatitis-B, Interferon, Eukaryota – szerű poszttranszlációs modifikációk (glikozilálás, fehérje jelölés) terápiás fehérje termeltetés •S. cerevisiae = GRAS –Generally regarded as safe, alapvetően biztonságos –Élelmiszeriparnak előnyös, kenyér, alkoholos italok előállítása –Változatos anyagcsere –Jól módosítható genom •“E. coli of eukaryotic cells” (James Watson) •Anaerob fermentáció fő terméke etanol, alkohol •Technológiától és alapanyagtól függő termékek •Bioetanol megújuló energiaforrás, üzemanyagként használják Eu-ban 5% a benzinbe, Mo-n keményítőből •Alapanyag összetétel fontos, Megújuló energiaforrás és a benzinével közel azonos az égéshője, ami a rendszer hatékonyságát segíti elő. Bár a benzintől a párolgáshője alacsonyabb és hidegben az autók elindítása nehezebb, azonban a tökéletes égés miatt fontos adalékanyag. Csak vízmentes etanolt lehet benzinhez keverni A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu •Fermentációs paraméterek –Hőmérséklet, Biomassza összetétel, pH, redox potenciál, Mikróba konzorcium összetétel •Gazdaságosság M.o.-n kérdéses sok esetben –Áram/hő vs. Gáztisztítás 10. Fonalas és kalapos gombák és biotechnológiai hasznosításaik. Fonalas gombák •Aspergillus niger: Aerob, fonalas, Spórás gomba, Fekete Citromsav, glükonsav gyártás: Currie elfelejtett puffert tenni az Aspergillus niger tápoldatába. A pH így nagyon alacsony lett. Megvizsgálta, s kiderült, hogy citromsav volt a tápoldatban. 1930-tól a citromsav termelés 95%-át gombával állítják elő, mert gazdaságosabb. Jó citromsavat gyártani, mert jól tartható. Aerob, alacsony szintű feltételek szükségesek: alacsony pH, alacsony Mn2+, sok cukor. Extracellulárisan keletkezik a termék és ez könnyebb kinyerés miatt jó. A termelésnél spórából indulnak ki, az biztosítja a tisztaságot. A fáraók mellé temetett ételen elszaporodott az Aspergillus niger, spórákat képzett, amit utána a történészek belélegeztek. a tüdőben kihajtott és nehezen gyógyuló tüdőgyulladást okozott. •Penész / Penicillium Sokféle, Ochratoxin: rohadó gyümölcsön lévő penicillimuok termelik. Karcinogén, felhalmozódik az izomban. Penicillium chrysogenum •Penicillin termelés, β – laktám antibiotikum, Gram + ellen, Sejtfal épülést gátolja •Fleming fedezte fel, mert befertőződött a munkája, nemi betegséget is gyógyít, 2. vh. után széleskörben használták •Penicillium roqueforti, P. camemberti – élelmiszeriparban a sajtok előállításánál használják Bioremediáció •Trichoderma reesei,- bioaktív anyagok termeltetése Celluláz, xilanáz, Biológiai növényvédelem Phanerochaeta chrysosporium, Lignint, aromásokat, poliaromásokat is bont, Illékony anyagok: Biofilter: fakérgen elszaporítjuk, ezen átvezetjük az illékony szennyező komponenseket tartalmazó levegőt, nagy felületen tisztítja a gázt. Anyarozs •Claviceps purpurea –Ergot alkaloidok •Ergotamin: peptidszármazék. Jó és kevésbé jó fiziológiai hatása van. Rossz: keringési rendszer., idegrendszer, érfal összehúzódás, szurkáló érzés a végtagokban, hallucináció, ájulás. Jó: migrénes fejfájás ellen. –Keringési és idegrendszeri hatások –Salemi boszorkányok •LSD – lizerginsav dietilamid –Anyarozs alkaloida származék –Szélsőséges, kiszámíthatatlan reakciók –“vallatószer”, már kis mennyiségben hallucinogen Kalapos gombák •Amanita muscaria –Légyölő galóca –Hallucinogén •Muscarin:Sámán + vizelete •Agaricus bisporus, champignon • “magic mushrooms”Azték kultúrában, de majáknál nem. Vidám önfeledt állapot •Koronázás, áldozat Pszilocin ≈ szerotonin: boldogságérzetet vált ki, kábítószer, emberre káros. A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 11. Mikróba tenyésztés általános és speciális feltételei. Első lépésben mindig az a fontos, hogy megfelelő körülményeket biztosítsunk a baktériumok számára, ezt tekintjük upstream műveletnek, majd a folyamat követően keletkezik a keverék, ami tartalmazza a baktériumot és a terméket is. Majd downstream folyamatok alatt ebből a keverékből történik a termékelválasztás. •Mivel nagyon különböző anyagcseréjű mikrobákat, használunk ezért változatos körülményeket kell biztosítani: •C+N+O+energia biomassza+CO2+H2O •Anabolizmus, Katabolizmus •Autotróf, Heterotróf •Litotróf, Organotróf •Fototróf, Kemotróf Általános feltételek Hőmérséklet: Psychrofil 0-25°C, mezofil 15-45 °C, termofil 35-65 °C, extrem termofil 60-105 °C. – Határ: folyékony, szabad víz – ±15 ºC, hűvösebb irányban jobban bírják a bacik, jobban képesek tolerálják •pH: a mikrobák az optimális növekedési ph esetében +/-2 ph-val képesek még eltérni és tolerálják •Prokarióták –C forrás – Monod egyenlet µ = µmax x S / (ks + S) azt jelenti, hogy egy darabig emelve a tápanyag koncentrációt, gyorsabban szaporodnak, de bizonyos értéken túl, hiába etetjük, nem szaporodik tovább, ennél több kaját nem érdemes neki adni. Nem lesz több a biomassza termelés. Szubsztrát gátlás lép fel: Bizonyos értéken túl, hiába etetjük, nem szaporodik tovább. Ks - Maximális növekedési sebesség feléhez eső koncentráció. –N forrás: szervetlen, szerves, Változatos hasznosítás, legtöbbjük szervetlen N-forrást használnak, NH3 és nitrát-sók formájában veszik föl –Oxigén forrás: Szervetlen ionok formájában veszik fel. NO3-, SO42•Aerob, obligát anaerob,fakultatív anaerob, mikroaerofil, aerorezisztens •Aerob – O2 Szuperoxid, H2O2, – Rossz oldékonyság vízben •Anaerob – NO3-, SO42•Energia ATP formájában hasznosítják és tárolják – 36-38 ATP/glükóz citrát ciklus és a légzési láncok során •Aerob •Anaerob – 1-3 ATP/glükóz Speciális vegyületek: Lipidek, Vitaminok 12. Ipari tápok. Ipari komplex tápok •Melasz: 50% cukor, Kevés szabad víz, Ásványi anyagok, a cukorgyártás melléktermékeként keletkezik a cukor kikristályosításakor, •Cukor: cukornád vagy cukorrépa az alapanyag, ezekből extrahálnak cukrot, ez vízoldékony, majd kristályosítják. Ami a cukorban jó (hasznos) alkotó elem az benne marad. Tartalmaz ásványi sókat, cukor származékot és nem cukorszármazékot. Steril, sötétbarnás színű, viszkózus lé. Alkohol készítésére is használták. •Tejsavó: tejgyártásból származik. Tej tejsavas erjedése, benne lévő fehérjék kicsapódnak, vizes fázis ott marad, kisebb mennyiségű tejcukrot tartalmaz, mivel a nagy részét a tejsav baktériumok kiették. pHja 4-4,5 körüli A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu •tejszűrlet- a tej feldolgozásának mellékterméke, a tej ulraszűrésekor keletkezik, kiszűrnek belőle mindent, ami 100kDa-nál kisebb, laktóz tartalma sok, Lipidek, Vitaminok •Ömlesztett “sajt”- nem savas erjedéssel készül sajt, fehérje zsírokat tartalmaz. A tej ultraszűrése követően fennmaradt termék. •Brunost sajt- édeskés sajt a sok karamelizált cukor miatt •Tej, tejföl, savó főzve • Kukorica szirup - keményítő elválasztásakor a maradék, sok cukor van benne és fermentációs alapanyag •α-amiláz, glükoamiláz, xilóz amiláz •Glutén, olaj •N és C forrás •Ásványi anyagok •Manióka: megvastagodott tároló gyökér jellemzi, szubtrópusi növény, megpucolják és kiszárítják, őrlik és liszt készülhet belőle, elterjedt •Keményítőben gazdag •Cianidot tartalmaz, Olcsó, •Igénytelen •Afrikában fő táplálék (40%) •Lignocellulóz: nagy tömegben keletkezik, sok cukort tartalmaz •1,4 – glükozid kötéssel polimer •Lignin: nagyon nehéz lebontani, ragasztóanyagként szolgál, A lignin biztosítja a növények szerkezetét. Sok aromás gyűrűt és fenolos OH csoportot tartalmaz. Fonalas gombák lebonthatják. Ilyen biomasszából van a legtöbb •Cellulóz, hemicellulózt felhasználás előtt a lignintől el kell választani Eukarióta tápok •Vízminőség •Kismolekulák •C forrás – 6C cukrok •N forrás – Gln, Glu, Asn, Asp megszintetizált amminósavak formájában •Vitaminok, Lipidek •Pl. Fetal Bovine Serum •Drága, Ismeretlen összetétel, Downstream folyamatot zavarja, Működik •Borjúszérum: Borjú vér alakos elemek nélkül a borjú szérum/savó. Összetétele ismeretlen, drága. Komplett táp, minden növekedéshez szükséges faktor megtalálható benne. •Hormonok, növekedési faktorok •Transzport fehérjék, Kötő fehérjék •Szervetlen komponensek pH=7.3-7.5 HEPES + fenolvörös( indikátor) •Fejlesztés: Szérum mentes tápok 13. Eukarióta sejttenyésztés jellegzetességei. 14. Sterilezési eljárások. Sterilezés •Aszeptikus és Dezinfekciós: Sterilezésnél két mód. Aszeptikus környezet: mindent eltávolítanak belőle, nincs benne fertőző anyag. Dezinfekciós: döglött mikróbát tartalmaz. •Folyadék vagy gáz –Folyadék •Szűrés: 2D: A szűrés a felületen történik, a kiszűrendő anyagok fenn maradnak a szűrőn A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 3D / ülepítés: Három térbeli kitettsége van, a kiszűrendő anyag a szűrő anyagával kapcsolatba lép, neki megy vagy valamiféle kölcsönhatás révén szűr. Háromféle mechanizmussal szűr: becsapódás, csapdázás, diffúzió •a pórus méret alapján megkülönböztetünk: •mikroszűrő:0,01 mikrométer a pórusátmérő, ennél nagyobbakat nem enged át a szűrőn. •Ultraszűrő:1000 Dalton a pórusátmérő, ennél nagyobbakat nem enged át a szűrő •egy nanoszűrő: 300 Dalton a pórusméret, ennél nagyobbakat nem enged át a szűrő •reverz ozmózis szűrő:50-500 Dalton, 5*10-10 – 5*10-9 méter • Inaktiválás kémiai módszer NaOCl, perecetsav Hypo: baj azonban hogy benne marad a rendszerben. Erélyes oxidálószer. Perecetsav: erélyes oxidálószer, ecetsav lesz belőle •Sugárzás •Elektromágneses A látható hullámhossz tartománya (400-700 nm) alatti, tehát 400 nm hullámhosszúságú tartomány alatti sugárzás alkalmas sterilezésre., • radioaktív sugárzás • Gáz: Gázoknál is 3D-s szűrőt használnak. A szűrés hatásfoka függ a sebességtől, egy ideig a sebességgel csökken a hatékonyság, de egy bizonyos kritikus érték után nőni fog a hatékonyság, a baktérium nem tudja kikerülni a szűrő anyagát. •Igény: 0,5-1,5 térf. levegő/perc •Kritikus sebesség = minimális hatásfok • 15. Oxigén ellátás és az anaerob fermentáció sajátosságai. Oxigén adagolás Az oxigén roszul oldódik vízben, fokozni az oldódást nagyon nehéz. Szén-dioxidhoz képes nehéz feladat, mert szén dioxid esetében megoldották pl szóda, pezsgő esetében. Ha növeljük a hőmérséklet, akkor még rosszabb az oldódás. A megoldás a membrán rendszer merítése a fermentorba ezáltal nagy felületet biztosítanak és egyenletes oxigén ellátottság. A felszíni levegőztetés a legkevésbé hatékony, ennél jobb a buborékos levegőztetés. Ennek a hatékonyságát keveréssel javították. A legjobb azonban a membránfermentor, ahol igen nagy felületet biztosítanak sok apró buborékkal, így az oxigén nagy felületen, egyenletesen tud bejutni. •Anyagtranszport limitál •O2 oldékonysága vízben rossz (7 ppm, 35°C),Ezzel mindig baj van Aerob - Anaerob fermentáció Anaerob fermentáció: oxigén kötött formában van jelen és tápanyagok pedig illékony szerves savak Sziráld halmazállapotú anyag fermentálása anaerob módon a silózás ez tejsavas erjedés jelet és édeskés ízt ad a zöld tápláléknak, az aerob módon történő fermentálás pedig a komposztálás. komposztálással a kémiai energia fele,amit vissza tudunk nyerni és ez hő formájába keletkezik ami nehezen tárolható, míg anaerob módon 90% amit visszatudunk nyeri és ez metán és szén dioxid keveréke •Gázok: H2, CH4 •Folyadékok: EtOH, tejsav, oldószerek •Szilárd termék: Sajt, savanyú káposzta, kovászos uborka A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 16. Biomassza kinyerése a fermentléből. Downstream műveletek folyamatai, amely során a termék és a baktérium keverékből az elválasztás történik: Lépései •Biomassza kinyerés •Sejt feltárás •Extrakció •Makromolekulák elválasztása •Kiszerelés Kinyerés: •Átfolyó henger: igények: Folyamatos üzem: Rövid tartózkodás, Kis helyigény, Zárt rendszer • Centrifuga: középen forgó alkatrész. Alulról történik a betáplálás Osztott cellás, Szeparátor, dekantáló: • Szűrés: Termék kinyerés, Sokféle Tangenciális: a legelterjedtebb: Félfolyamatos szűrés, az elve, hogy a szűrők síkjával párhuzamosan áramlik a szűrendő folyadék, így sokkal később tömődnek el a szűrőlyukak, mint a merőlegesen áramlónál. Egyenletes a lerakódás és ritkábban kell lekaparni a fennmaradt anyagot. •Változtatható paraméterek Hollow fiber: A leghatékonyabb szűrés a hollow fiber, nagyon vékony csöveket (lyukacsos hajszálakat) összefognak, műgyantába ágyazzák). A vékony fal miatt nagy specifikus felületet biztosítnak a vékony csövecskék. A szűrés a csövek falában, kis lyukakon történik. Alul a csövekből távoznak a kisebb molekulák, és kívül maradnak a nagyobbak. Gyógyászatban használatos termékkinyerési módszer: Hemodialízis: holow fiber(lyukacsos hajszál) elven működik. Nagyon vékony, lyukacsos falú csöveken át áramoltatják a beteg vérét, az apró méretű molekulák (salakanyag) a csövek végén, alul távoznak. A beteg megszűrt véréhez, mielőtt visszavezetik a véráramba fiziológiás sóoldatot adnak, a folyadékvesztés miatt. 17. Sejtfeltárási eljárások. Downstream folyamatok közé sorolható: •Sejt feltárás: Mechanikus •French press: Nagy nyomás, Súrlódási hő: Az anyagot kis nyíláson keresztül passzírozzuk, a nyílás összemérhető a feltárandó sejt méretével, az átjutott sejtek a nyomáskülönbség következtében szétdurrannak. •Ultrahang: Mikrohullámú feltárás nem alkalmas feltárásra, mert a sejt belsejében lévő vizet forralja fel, kevés termék bírja ki a lokális magas hőmérsékletet. Az ultrahangos sejtfeltárásnál a sejtet szétrázza az ultrahangozás, golyók és vágókések tehetők még a sejtszuszpenzióhoz, ez nem bántja terméket, jól használható sejtfeltárási módszer •Vágókés (turmix) •Golyós homogenizálók: Egyenletes méretű golyók közé tesszük a sejtet. A golyók anyagának megfelelő keménységűnek kell lennie, emellett még a méretük sem lehet túl nagy, mert a sejtek megbújnának közöttük. –Vegyszeres •Szerves oldószer (toluol, etanol, aceton) •Detergens •Guanidin HCl, Lúg, sav •Enzim: lizozim (Gram + peptidoglükán)- legfinomabb, kénes termék esetében 18. Kis molekulasúlyú termékek kinyerése. Kis molekulák esetébe: A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu • Extrakció- folyadék fázisból való kinyerés –Micella, reverz micella: Hasonlóság a micella és reverz micella között, hogy mindkettő foszfolipid kettős rétegből áll. A micella hidrofil része van kívül, hidrofób farki része pedig belül. A reverz micell ánál pont fordítva van, a hidrofil része van belül és a hidrofób része kívül –Kristályosítás •Makromolekulák: Fehérje extrakció: Megoszlás különbség alapján választ el. Micellába zárjuk őket és átrázhatók a hidrofób fázisba. –Lipáz esetén (mosóporoknál használják) a szubsztrátjukat beépítjük a határfelületre. Kialakul az enzim-szubsztrát rendszer. Ezután átvihető a hidrofób fázisba •egyedi optimalizálás •Szuperkritikus folyadék: A szuperkritikus folyadékokat termék kinyerésére használják, a termékkioldása után, azt megmelegítve elpárolog a folyadék. Pl a CO2-ot használják így, ha a termék nagyon érzékeny és gyorsan kell kinyerni. •Bármilyen anyag egy kritikus nyomás és hőmérséklet felett •Szilárd anyagban diffundál, mint gázokra jellemző •Anyagokat old, mint a folyadékok (pl. szerves oldószerek) •Nincs felületi feszültség és folyadék-gáz határfelület •Szuperkritikusok egymással korlátlanul elegyednek •A kritikus nyomás körül a sűrűsége megnő, anyagok oldékonysága a nyomással arányos –CO2 : Tc = 31.1 °C, Pc = 73.8 bar •Szuperkritikus extrakció –Előny: Jó oldékonyság, Oldószer melegítésre maradéktalanul elválasztható, Gyors –Hátrány: Drága, Új technológia HPLC + GC: elválasztás: HPLC: Előnye: gyorsan jut át az anyag az oszlopon - gyorsabb, éles csúcsok, nem kenődnek el, tiszta szétválasztás, jó felbontóképesség, nagy érzékenység és hatékonyság. Hátránya: a nagy nyomás a makromolekuláknak nem jó, csak kismolekulájú terméket lehet vele mérni, gyakori oszlopeltömődés, túl speciális eszközök. –Hidrofób fehérjék kinyerése –Koffeinmentes kávé, Nikotinmentes cigaretta –Lupulin kinyerés komlóból –Gyorstisztítás –Oldószer eltávolítás A termék kinyerése: Kromatográfia Hordozó gömbök : Kölcsönhatás a fehérjével: méret, elektrosztatikus, hidrofób, affinitás A fehérjék elválasztása a fehérjék tulajdonságai alapján: méret szerinti elválasztás, elektrosztatikus töltés szerinti (felületi töltés, össztöltés), hidrofóbicitás és affinitás alapján lehet. Elválasztás kromatográfiával történik. Az oszlopot megtöltjük inert hordozóval. Ennek a felszínére olyan csoportokat tesznek, melyek megváltoztatják a már meglévő csoportot, hidrofób-hidrofil, töltött oldalláncok. Kölcsönhatás a fúziós csoporttal. Ezután szelektíven leküldjük a fehérjéinket az oszlopról. Az inert hordozóknál fontos, hogy azonos méretűek legyenek. A modern kromatográfiás hordozók gömbök (gyöngyök) polimerből, üvegből készülnek A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 19. Méret szerinti elválasztási, tisztítási eljárások. • Porózus járatok- a megtett úthossz függ a mérettől • Nagy molekula = rövidebb úthossz • Diffúzió miatt széles sávok • Hagyományos / perfúziós A hordozó anyagon belül járatok vannak. A nagyon mérettű hamarább lejön az oszlopról. Minél kisebb, annál több járatba fér be, annál hosszabb utat tesz meg. A fehérjék mozgása különböző mértékben lelassul. A nagyoknak kevésbé lassul a mozgása, mivel nem férnek be olyan sok helyre. Éppen ezért ők hagyják el először a rendszert Csinálunk bogyókat, oszloptöltéseket, aminek a belsejében zegzugos járatok vannak. Ezek mérete összemérhető a fehérjék méretével. Be is bújnak ezekbe a járatokba. A fehérjék mozgása különböző mértékben lelassul. A nagyoknak kevésbé lassul a mozgása, mivel nem férnek be olyan sok helyre. Perfúzius kromatográfia: Egy bogyó belsejében különböző utakat tesz meg a fehérje. A perfúziós kromatográfiában széles járatokat hoznak létre, a golyónak csak kis térrészében marad meg a vándorlás Hatékonyság javítása: bogyókban lévő járatok, barlangok méretét, hosszát, átmérőjét változtatva lehet jobb feloldást/felbontást elérni 20. Töltés szerinti elválasztási eljárások. Töltés szerinti elválasztás •Aminosavak zwitterionok •(+) és (-) töltésű oldalláncok •Felületi töltés ≠ össztöltés •Izoelektromos pont: Töltés szerinti elválasztásoknál használható. Ezen a pH értéken a fehérje töltése nulla, elektromos térben nem mozog. Minden fehérjén vannak pozitívan és negatívan töltött aminosav oldalláncok, különböző pH-n, különböző módon ionizálódnak. Ha a töltések száma megegyezik, a fehérje molekula kifele semleges, itt az izoelektromos pontja. • - elektroforézis: A fehérjék elektromos térben mozognak térhálós polimerben. A negatív töltésűek a pozitív pólus felé mozognak. A fehérjéket bebugyolálhatóak, olyan detergensekkel, ami negatív töltést ad nekik. Így tehát a fehérjéket méret és töltés alapján is el lehet különíteni. Összetétel meghatározásra való. Analitikai módszer – ioncserélő kromatográfia: Attól függ, hogy hány az oszlop töltésével ellentétes töltésű aminosav van a fehérjében. Szorítjuk le a fehérjéket az ioncserélő oszlopról: Ha neki megyünk másik töltött részecskékkel (általában só molekulákat használunk), akkor egy bizonyos koncentráció (ez a sóé) már egyre több fehérje enged. •Felületi töltés alapján választ el •Töltött aminosav oldalláncok elektrosztatikus kölcsönhatásba lépnek a hordozóval •Anioncserélő, kationcserélő oszlop, Preparatív módszer – izoelektromos fókuszálás: Össztöltés alapján választ el. PH grádienst kell létrehozni a rendszerben. E mentén mozgatjuk a fehérje molekulákat. Elektromos térbe helyezzük őket, addig vándorolnak, amíg kifelé nem lesz nettó töltésük. A pH skála mentén mindegyikük beáll a saját izoelektro