Biotechnológia I-II.

Előnézet

A jegyzetről

Biotechnológia I-II. jegyzetek, tételek, zh-k kidolgozva

Vásárlás (500 Ft)

Név

Biotechnológia I-II.

Típus

Felsőoktatás

Tantárgy

Biotechnológia

Év

2019

Szak

Biológia

Intézmény

Szegedi Tudományegyetem

0 letöltés

Szerző

b.hanna

Létrehozva

2021-12-30

Oldalak száma

Jelentem

1. tétel A nukleinsavak általános jellemzői, formái, tisztításuk. A nukleinsavak a genetikai információ hordozói és továbbítói. Biokémiailag nézve polimerek, olyan polinukleotidok, amelyek mononukleotid alapegységekből állnak. A mononukleotidok három alkotórészből épülnek fel: - cukor (dezoxiribóz, ribóz) - foszforsav - és egy purin vagy pirimidin bázis → A nukleinsavaknak két típusa van: DNS és RNS DNS: Építőegységei: → dezoxiribóz → 4-féle bázis: └> purin bázisok: adenin (A), guanin (G) └> pirimidin bázisok: citozin (C), timin (T) → foszforsav Prokarióták kromoszóma, nincs sejtmag extrakromoszómális elemek plazmidok fágok ELŐFORDULÁS Eukarióták kromoszóma, sejtmag mitokondrium, kloroplaszt egyéb extrakromoszómális elemek plazmidok vírusok 1 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Felépítése: → DNS kettős spirál, anti-paralell lefutású szálakkal (5’ → 3’ illetve 3’ → 5’) → A-T (2 H-híd), G-C (3 H-híd) párosodás A DNS térszerkezetét Watson és Crick oldotta meg l953-ban. A modell kidolgozása részben a DNS-ről készült röntgen diffrakciós adatokon, a Chragaff szabályokon, és a DNS és alkotórészeiről felhalmozódott kémiai ismereteken alapul. A röntgen diffrakcióval kapott adatok azt jelezték, hogy a molekula fonálszerű, egyenletes átmérőjű, spirál alakú. A nukleotidok szabályosan ismétlődő távolságokban egymás felett helyezkednek el, síkjuk merőleges a szál hossztengelyére. A bázisok egymásra fekvése, a stacking jól megfigyelhető. A bázisok a kis és a nagy árokban férhetők hozzá kívülről például fehérjék számára. Méretei (B forma): → átmérő: 20Å (2nm) → menetemelkedés: 34Å (3,4nm) → kisárok:0,34nm → nagyárok: 3,4nm A DNS kettős spirált összetartó kölcsönhatások: - a szemben álló bázisok közötti hidrogén hidak - az egymás fölötti bázisok közötti hidrofób kölcsönhatás - a két szál foszfátcukor gerince közötti elektrosztatikus taszítás Formái: → lineáris/cirkulásris → ds/ss (az egyszálú nukleinsavak szerkezeti jellegzetességei: hajtű szerkezetek és hurkok) csavarodás iránya alak tengely A forma jobbra rövid, széles nagy árok nagy árok szűk, mély kis árok nagyon széles B forma jobbra hosszabb, vékony bázispárokon át széles, közepesen mély szűk közepesen mély előfordulás dehidratált természetes gikozidos kötés anti anti 11 10,4 12 +34,7o +34,6o -30o 0,25 nm 0,34 nm 0,57 nm 2,3 nm 1,9 nm 1,8 nm fordulatonkénti bp-ok száma rotáció bp-onként emelkedés bponként kettősspirál átmérő Z forma balra megnyúlt, karcsú kis árok felületen kisimult nagyon szűk és mély (Pu-Py)n, magas só c esetén, metiláció esetében anti (C) szün (G) 2 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu → egyéb fomák: három szálú DNS (Hoogsteen triplex), D és E forma (guaninok eltávolítva) Hibridizáció: → két külön forrásból származó DNS szál párosodása → lehet: DNS-DNS DNS-RNS RNS-RNS Annealing: → azonos forrásból származó előzőleg denaturált DNS szálak párosodása Chargaff szabályok: → a purin bázisok mennyiségének összege megegyezik a pirimidin bázisok összegének mennyiségével (A+G=T+C) → az adenin mennyisége mennyisége megegyezik a timinével, illetve a guanin mennyisége megegyezik a timin mennyiségével (A=T, G=C) → a különböző fajok A+T/G+C hányadosa jelentősen eltér Olvadási hőmérséklet: → Tm, a természetes DNS-é 85-95oC └> melting point → a DNS 50 százaléka megolvadt állapotban található →a GC tartalom függvénye, 1%-os növekedés a GC tartalomban; kb, 0,4oC emelkedés a Tm-ben (magyarázat a GC bázisokat 3 hidrogén híd kötés kapcsolja össze a az AT bázisok 2 hidrogén hídjával szemben) Hiperkróm effektus: → a denaturáció során fellépő effektus, lényege, hogy a denaturált DNS fényelnyelése az UV tartományban kb. 40% nagyobb, mint a natív ds DNS-é (a spektrum alkja nem változik, csak a fényelnyelés mértéke nő) └> az ok: a bázisok elektron rendszerének kölcsönhatása a kettős láncban, ha megbomlik a dupla hélix az OD nő Linking number (L): → a csavarulatok száma amivel a duplex két szála keresztezi egymást, (leegyszerűsítve a tekeredés és csavarodás együttese) → természetes állapotban a DNS negatívan szupercoiled 3 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Topológiai izomerek: → olyan DNS molekulák, amelyek csak a linking numberben különböznek. Topoizomerázok: → enzimek, amelyek képesek megváltoztatni az L-t I. tipusúak: egy szálon hoznak létre törést-újraegyesítést, II tipusúak: mindkét szálon törés-újraegyesítés DNS tisztítása (DNS preparálás biológiai mintákból) → kromoszomális DNS, plazmid DNS 1. A sejtek összegyűjtése és feltárása: → a sejtek összegyűjtése centrifugálással történik → a forrás és a DNS típusától függően a kezelés eltérhet, történhet: - sejtfalbontó enzimekkel (lizozim, litikáz, proteináz K) - detergenssel (SDS) - hő (50-60 0C) - ozmotikus hatásokkal (pl.: glükózt magas koncentrációban tartalmazó pufferrel) - lúgos kezelés (alkalikus oldattal) - fém kelátorokkal (pl.: EDTA → nukleázok működéséhez elengedhetetlen kétértékű fémionok kelátolását végzik) - fagyasztás – felmelegítés - French- press a sejtek feltárása során kerülni kell a DNS mechanikai törését - ultrahangos szonikálás 2. Egyéb sejtalkotók eltávolítása: └> lipidek, poliszaharidok:  szelektív kicsapás a sejtfeltárás körülményei között (SDS-es kicsapással, egyértékű fémionok jelenlétében: a fémionok hatására kicsapódó SDS a sejttörmeléket eltávolítja)  szerves extrakció, fenol-kloroform elegyével └> fehérjék:  fehérje bontó enzimek alkalmazása: proteináz K  szerves fenol/ kloroform/ izoamilalkoholos (25/24/1) extrakció: a fenol denaturálja a fehérjéket (azért használják kloroformmal együtt, mert a protein mentesítés hatékonyabb, ha két különböző szerves oldószerrel végzik. Az izoamilalkohol a fenolos szerves és a DNS-t tartalmazó vizes fázis tökéletesebb szétválását tesz lehetővé) 4 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu └> RNS:  szelektív kicsapás LiCl oldattal  RNáz enzimek alkalmazása 3. A DNS kicsapása: → etanolos vagy izopropanolos kicsapás: a kicsapás mindig alacsony koncentrációban jelenlevő, egyértékű fémionok jelenlétében történik pl.: Na-acetát └>az alkohol vízelvonóként viselkedik, így tud kicsapódni a DNS └> a kromoszómális DNS nagy mérete miatt kampós végű üvegbottal kiemelhető az eppendorf csőből └> minél nagyobb egy DNS, annál könnyebben törik (20 kbnál nagyobb DNS erős fizikai behatásnak, vortexes keverésnek nem tehető ki) 4. A koncentráció és tisztaság ellenőrzése: A, koncentráció → fotometrálással: A koncentráció kiszámítása az OD260 alapján: 50 µg/ml dsDNS koncentrációjú oldat 260 nm-en mért optikai denzitása=1. → gélelektroforézis: Sokkal érzékenyebb, mint a fotometrálás, mert már 1-5 ng-nyi menyiségű DNS is detektálható vele. A DNS-t ethidium bromiddal tesszük láthatóvá UV fény alatt, a fluoreszcencia intenzitása arányos a DNS mennyiségével. B, tisztaság A DNS 260 nm-en fényelnyelést mutat, a fehérjék pedig 280 nm-en. Ha a két fényelnyelés érték hányadosát vesszük, az a DNS tisztaságára utal. OD260/OD280= 1,8-2,0. Egyéb tisztítási módszerek: Kromatográfia: - ioncserés: → DNS kötő ioncserélő kromatográfiás mátrixok használata: pl.: hidroxi-apatit oszlop, szilikagél → a tisztítás során a DNS felkötődik az oszlopra, majd só eluálással eltávolítható onnan (kötés alacsony, elúció magas sókoncentráció esetén) - üveggyöngy: → a DNS-t meg lehet kötni az üveggyöngyök felületén, majd eluálni lehet onnan Kicsapás polietilén-glikollal: → nem lehet vele tökéletesen szétválasztani a cirkuláris és a kettős szálú törést tartalmazó plazmid DNS-t 5 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu CsCl-ethidium bromid gradiens centrifugálás: → az ethidium bromid eltérő mennyiségben tud beépülni lineáris, cirkuláris, vagy másodlagos szerkezeteket felvett DNS-be, ennek megfelelően a különbőző formájú DNS molekulák eltérő sűrűségűek lesznek → CsCl oldatban hosszas centrifugálás alatt sűrűség gradiens alakul ki, ebben a gradiensben a DNS a neki megfelelő sűrűségű részen fog elhelyezkedni. Gélelektroforézis: A poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) A PAGE során bifunkcionális N,N-metilénbisakrilamiddal keresztkötött akrilamid polimerek által létrehozott gélben futtatjuk a DNS mintáinkat. A polimerizáció szabadgyökök jelenlétében zajlik le, melyet általában ammónium perszulfát (APS) szolgáltat , és TEMED (tetrametiletiléndiamin) stabilizál a láncreakció során. A gél pórusméretét a polimerek hossza és a keresztkötések száma határozza meg. Ezeket a tulajdonságokat az akrilamid koncentrációjával, és az akrilamid : bisakrilamid arányának megválasztásával befolyásolhatjuk. Agaróz gélelektroforézis DNS fragmentumok elválasztásának, azonosításának és izolálásának alapvető módszere. Agaróz gélelektroforézissel 0,2-50 kb tartományban különíthetők el a DNS fragmentumok, az agaróz koncentrációjától függően. Ha elektromos térbe helyezzük a gélt, a DNS- mivel semleges pH közelében negatív töltésű- az anód felé vándorol. A gél a futás alatt horizontálisan helyezkedik el, az alkalmazott elektromos teret állandó irány jellemzi. Az egyes fragmentumok pontos helyzete a gélben közvetlenül meghatározható egy fluoreszcens interkaláló festéket, az etídium bromidot alkalmazva: UV fényben vizsgálva a gélt, néhány ng DNS is láthatóvá válik fluoreszcenciája következtében. Szükség esetén a DNS izolálható a gélből és felhasználható további génmanipulációs célokra. 6 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu A DNS mozgási sebességét több faktor is befolyásolhatja, ezek a következők: → a DNS mérete: Minél kisebb egy molekula annál gyorsabban képes vándorolni a térhálóban. Ezzel a módszerrel a különböző formájú DNS molekulák is szétválaszthatók pl.: egy szupercoiled DNS kompaktsága miatt könnyebben elfér és halad a térhálóban, mint egy cirkuláris. → az agaróz koncentrációja: Ez határozza meg a gél sűrűségét és a pórusok méretét. Különböző agaróz koncentrációjú gélek elválasztási tartománya a következő: DNS izolálása gélből Sok eljárás ismert, ezek alkalmazásakor az első lépés mindig az, hogy a gélben elválasztott, ethidiumbromiddal megfestett fragmentumot tartalmazó gélszeletkét kivágjuk (steril pengével) és elkülönítjük a gél többi részétől. Az elkülönített gélszeletkéből aztán a DNS-t visszanyerhetjük: → egyszerűen kidiffundáltatva belőle, elektroelúcióval → agaróz enzimatikus emésztése agarázzal → elektrodialízis → dializáló hártyában Kromatográfiás módszerek → a gélszeletkét pufferben (kálium jodidban) feloldva, a DNS-t pedig valamilyen azt megkötő mártixon (üveggyöngy, hidroxi apaptit) visszanyerve → a gélben a fragmetum elé egy DEAE (dietilaminoetil) csoportokat tartalmazó kromatográfiás papírszeletkét helyeznek és folytatva az elektroforézist a DNS-t a papírra futtatják, ahol az megkötődik (a kromatográfiás mártixokról, papírról a DNS magas só tartalmú pufferrel eluálható) Fagyasztásos módszer → a kivágott DNS-t tartalmazó agarózdarabot -80oC-on megfagyasztjuk, emiatt az agaróz szerkezete roncsolódik, a DNS egy szűrőn keresztül centrifugálással kinyerhető, további tisztítás szükséges, univerzális ═> a kinyert DNS további tisztítása fenolos extrakcióval, alkoholos kicsapással történik 7 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu RNS Építőegységei: → ribóz → 4-féle bázis: └> purin bázisok: adenin (A), guanin (G) └> pirimidin bázisok: citozin (C), timin (U) → foszforsav Minden szervezet RNS molekulák segítségével szintetizál fehérjéket. Néhány egyszerű szervezet (vírusok) örökítőanyaga RNS. Egyes RNS molekulák katalitikus tulajdonságokkal bírnak, így enzimfunkciót is betöltenek (ribozimek). Típusai: mRNS: molekuláiban nincsenek bázispárok, a gének mellett szintetizálódnak, azok információtartalmát közvetítik a fehérjeszintézis során tRNS: molekuláiban a láncon belüli bázispárok jellegzetes hurkokat alakítanak ki, amelyek feladata az aminosavak szállítása a fehérjeszintézis helyére rRNS: molekulái a riboszómák felépítésében vesznek részt 8 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu RNS tisztítása Az RNS molekula nagyon könnyen degradálódik, ezzel szemben az RNázok stabilak. A tisztítás során RNáz mentesíteni kell mindent! DEPC: dietil pirokarbonát (RNáz inhibítor) O O O O O Sok eltérő protokol, ma univerzálisan használható rendszer a guanidium isotiocianát-fenol-kloroform oldattal történő extrakció. Egy lépésben végzik el a sejtfeltárást és a szerves-vizes folyadék fázisú extrakciót. A vizes fázis csak totál RNS-t tartalmaz ( és némi kromoszómális DNS szennyezést, DNáz kezeléssel eltávolítható). mRNS tisztítás: → eukarióták esetén poli A farok alapján mRNS tisztítás eukarióták esetén stabil poliA farok mRNS h o TTTTTTTTTT- r d o z ó AAAAAAAAA tRNS rRNS magas só mRNS h o AAAAAAAAA TTTTTTTTTT- r d o z alacsony só ó mRNS AAAAAAAAA 9 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 2. tétel Restrikciós endonukleázok, metilázok, polimerázok I. Restrikciós endonukleázok Felfedezésük: A hetvenes évekig a kromoszómán belül egyetlen génnek az elkülönítése még megoldhatatlan feladatnak tűnt. A fehérjemolekulákkal szemben ugyanis a gének a sejten belül nem önálló egységként, hanem az óriási DNS molekula részeként találhatók. Ráadásul minden gén ugyanabból a négy építőkőből (dezoxiribonukleotidokból) épül fel, és szerkezetük is egységes. E nehézségek áthidalását a restrikciós endonukleázok felfedezése jelentette. A restrikciós endonukleázok olyan, baktériumokból izolálható enzimek, melyek a DNS kettős-spirál specifikus helyen történő vágására képesek. Ezeket az enzimeket a baktériumok az őket megtámadó vírusok DNS-ének lebontása céljából termelik. A baktérium sejt a saját DNS-ének lebontását a felismerési szekvenciák metilezésével kerüli el. Vágási szekvencia felismerése: A restrikciós endonukleázok egy-egy specifikus, az adott enzimre jellemző, 4-8 nukleotidból álló, palindrom szekvenciát ismernek fel a DNS-ben és azok mentén hasítják a foszfodiészter kötéseket. Csoportosítás: I. A DNS-t szabálytalanul, azaz akárhol hasítják. Tandem enzimek, vagyis a modifikációs metiláz és a restrikciós endonukleáz aktivitást ugyanaz a fehérje hordozza. Mg2+ és ATP szükséges a működésükhöz. II. Célszekvencián belül hasít, szintén Mg 2+ és ATP igényes. A modifikációs metiláz és a restrikciós endonukleáz aktivitást két külön fehéjemolekula hordozza. III. A célszekvencia közelében hasítanak, szintén tandem enzimek. Mg2+ és ATP szükséges a működésükhöz. Ragadós és Tompa vég: A hasítás eredményekényt: → 5’-P és 3’-OH, tompa/blunt → vagy 3’ és 5’ túlnyúló, ragadós/sticky vég (egyesszálú rész) keletkezhet Ragadós vég: a DNS kettős láncot az endonukleáz nem pontosan szemközt vágja el (ferde hasítás). A ragadós végek össze tudnak kapcsolódni egy velük komplementer szállal. Ennek eredményeként kompatibilis véget adó enzimmel emésztett, ragadós véggel rendelkező DNS-ek összekapcsolhatók. (Kompatibilis véget adó enzimek: különböző forrásból izolált, különböző felismerő hellyel rendelkező, de azonos ragadós véget adó enzimek.) Két vagy több különböző DNS fragmensből ílymódon létrejött molekulát nevezzük rekombináns DNSnek. Tehát különböző szervezetekből restrikciós endonukleázokkal nyert DNS-fragmentumok összekapcsolhatók egyetlen, biológiailag működő hibrid DNS-molekulává. Ezáltal olyan, szaporodni is képes új rekombinánsok hozhatók létre, amelyek korábban nem fordultak elő. Az így létrejött hibridek továbbszaporítását nevezzük klónozásnak. Speciális nevezéktan: A restrikciós enzimek arról a mikroorganizmusról kapják a nevüket, amiből izolálták őket. Az első három betű a faj latin nevéből ered (Escherichia coli), a következ néhány betű /szám a törzsre utal (R), az elnevezés végén a római szám pedig a törzsben lévő többféle enzim megkülönböztetésére szolgál (lásd EcoRI, EcoRV). Izoschizomerek: Különböző forrásból izolált, de azonos célszekvenciát felismerő restrikciós endonuklázok. 10 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu II. DNS metilázok → DNS-t metilálnak megfelelő felismerési szekvenciánál. N A, dam metiláz (dezoxi adenin metiláz) → 5’ GATC 3’ felismerő hely, N6 pozícióban metilez → sok dam metiláz érzékeny enzim van pl.: MboI, XhoI, → egyenként ellenőrizni kell, érzékenység esetén: - dam- törzs használata - nem érzékeny izischizomer használata (ha van) N N N N adenin B, dcm metiláz (dezoxi citozin metiláz) N → 5’ CCAGG 3’ vagy 5’ CCTGG 3’ felismerő hely, C5 pozícióban metilez N N O citozin => Sok metiláz van még, restrikciós enzimekhez hasonló felismerő szekvenciával. Metiláció függő restrikciós rendszerek Az ilyen esetekben, csak akkor hasiítíník az endonukleázok, ha metilált a DNS. Pl.: - mrr → 6 metiladenin esetén hasít - mcrA → m5CG szekvencia kell a hasításhoz - mcrB → Pum5C esetén hasít Metilázok felhasználási területe: A, DNS védelme a hasítások ellen B, Laza specificitású restrikciós helyek specificitás növelése : → ha az egyik szekvencia tartalmazza a metiláz felismerő szekvenciáját (pl. HincII: GT PyPu AC, amiből GTCGAC a TaqI metiláz felismerőhelye → HincII metiláz érzékeny, így a többi restrikciós hely specifitása nő) C, Metiláció függő restrikciós helyek előállítása III. Polimerázok → szintézist végző enzimek - DNS függő DNS polimerázok - RNS függő DNS polimerázok - 5’  3’ polimeráz aktivitás Templátfüggetlen DNS polimeráz DNS függő RNS polimeráz 11 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu → legtöbbjüknek primer kell, aminek van szabad 3’ vége → ezt képesek folytatni → a promóter a polimeráz kötőhelye, intakt része a génnek DNS dependens DNS polimerázok → DNS megkettőződésében van szerepük DNS polimeráz I. (holoenzim) → aktivitásai: - 5’ → 3’ polimeráz aktivitás (DNS szintézis) - 5’ → 3’ exonukleáz aktivitás (dsDNS bontása 5’ vég felől, RNS emésztése DNS-RNS hibridről) - 3’ →5’ exonukleáz aktivitás (DNS emésztése 3’ vég felől) - exchange reakció/proof reading (ha csak egy dNTP van jelen, akkor az enzim visszaemészt addig a pontig, ahol komplementer bázis van szemben a kettős szálon; majd folyamatos szintézis és csere játszódik le ezen a ponton) └>DNS jelölésre alkalmas: radioaktívan jelölt dNTP használata → működéséhez Mg2+ kell DNS jelölés, nick transzláció → DNáz I-el nickeket hozunk létre mindkét szálon (nem egymással szemben) → Polimeráz I-el kiszélesíjük (exonukleáz aktivitás) └> gap-et kapunk → Polimeráz I-el, radioaktívan jelölt dNTP-ket építünk be, feltöltjük a gap-eket (polimeráz aktivitás), majd az egészet ligázzal összekapcsoljuk Polimeráz I. Klenow fragment (holoenzim része) → aktivitásai: - 5’ → 3 polimeráz - 3’ → 5’ exonukleáz (ss/ds DNS emésztése 3’ vég felől) - exchange reakció (proof reading) → működéséhez Mg2+ kell 12 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu DNS jelölés, random priming → DNS denaturálása → hibridizálás random szekvenciájú primer keverékkel → véletlenszerű bekötés → Klenow fragmenttel felötlés, jelölt dNTP-ket alkalmazva → végül denaturálás => jelölt szálakat kapunk Bakteriofág T4 polimeráz → aktivitásai: - 5’ → 3’ polimeráz - 3’ → 5’ exonukleáz → Klenownál 200X hatékonyabb (ssDNS-en!) - exchange reakció (proof reading) DNS függő termofil DNS polimerázok → magas hőmérsékleten is stabilak, PCR-hoz használják őket Taq polimeráz → 90 oC-n 40 perc a féléletideje → 5’ → 3’ polimeráz aktivitás → nincs proof reading aktivitása → 10000bp/hiba → Mg2+ igényes Pfu polimeráz → 5’ → 3’ polimeráz aktivitás → 3’ → 5’ exonukláz aktivitás → van proof reading aktivitása → 1,3millió bp/hiba , de nagyon lassú, ezért Taq-al együtt szokták alkalmazni (Fusion: mesterséges rekombináns) Templát független DNS polimerázok → se primert, se templátot nem igényel → mindössze 3 bázist igényel a DNS szálon való megtapadáshoz → Co2+ kofaktor jelenlétében: tompa végű dsDNS vagy 3’ vég felől visszaemésztett DNS a templátja → Mg2+ jelenlétében:T és C preferancia, míg Mn2+ jelenlétében: A és G preferancia → ssDNS jelölésre, homopolimer farok kialakítására használják 13 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu RNS függő DNS polimeráz/Reverz transzkriptáz → RNS-ről ír át DNS-t → aktivitás: - 5’ → 3’ polimeráz aktivitás - RNáz aktivitás (5’ → 3’ és 3’ → 5’ exoribonukleáz) → nincs proof reading aktivitása! → felhasználása: cDNS könyvtárak létrehozása, reverz transzkriptáz kapcsolt PCR-nál DNS dependens RNS polimerázok → aktivitás: - 5’ → 3’ polimeráz aktivitás → Bakteriofág SP6 T3 és T7 polimerázok a megfelelő promóterhez kötődve DNS- ről RNS-t írnak át 14 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 3. tétel Kinázok, ligázok, foszfatázok, nukleázok Kinázok → 5’ OH végen foszforilálnak (ATP γ-foszfátját DNS vagy RNS 5’ végére illesztik) → radioaktív foszfát jelenlétében DNS jelölésre használható Bakteriofág T4 polinukleotid kináz → ss/dsDNS és RNS-t is képes foszforilálni bár a túlnyúló 5’ ssDNS-nél a leghatékonyabb → megfelelő mennyiségű ATP mellett azonban képes a tompa vagy visszaemésztett 5’ vég foszforilálása is → nickek és gap-ek foszforilálására is alkalmazható megfelelő enzim koncentráció és ATP jelenlétében → exchange reakció: jelölésre alkalmas └> nagymennyiségű ADP jelenlétében az enzim az 5’ végi ATP-t ADP-re cseréli, majd ezt utána jelölt ATP-vel visszacserélhetjük └> Mg2+ kell a működéséhez └> a jelölés hatékonysága az ssDNS-nél a legjobb (96%), Ligázok → foszfodieszter kötés létrehozása poli- és oligonukleotidok 5’ foszfát és 3’ hidroxil csoportjai között → tompa és ragadós végek összekapcsolása, nick-kek megszüntetése → remekül alkalmazható vektor és fragment összekapcsolására └>a reakciókhoz ATP szükséges!!! Bakteriofág T4 DNS ligáz → tompa és ragadós végek összekapcsolása DNS szálak összekapcsolása. Optimuma 16-22 C fok. *Crowding effekt (tömörülési effektus): → ligáláskor a ligáló elegyhez PEG-et (polietilén-glikolt) adnak, ez egy nagy térkitöltésű molekula, így az elegy többi része a maradék helyre tömörül => hatékonyság növelése Bakteriofág T4 RNS ligáz → 5’ végi foszfát akceptorok: ssDNS/RNS → foszfát donorok: ssDNS/RNS valamint nukleotidok Foszfatázok → az 5’ végi foszfát csoportot emésztik le DNS-, RNS-, rNTP és dNTP-ről. → vektor önligálódásának elkerülésére használható: az 5’ véget defoszforiláljuk, így a ligáz nem tudja összekapcsolni a vektort a saját 3’ végével → felhasználható továbbá DNS jelölésre (emésztés majd foszforilálás jelölt 32P-vel) → BAP (bakteriális alkalikus foszfatáz) => nagyobb aktivitású, azonban hővel és detergensekkel szembeni ellenállósága miatt nehezebb inaktiválni → CIP (borjú intesztinális foszfatáz) => kevésbé aktív, viszont proteináz K-val vagy hővel remekül inaktiválható 15 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Nukleázok → DNS/RNS bontó enzimek melyek lehetnek exo-, vagy endonuklázok → az endonukleázok a szál belsejében hasítanak, az exonukleázok a szál valamely végén → az exonukleázok attól függően, hogy melyik végen hasítanak lehetnek 5’ → 3’ ill 3’ → 5’ exonukleázok Exonukleáz III. → aktivitás: - 3’ → 5' exonukleáz: ss/dsDNS lehet szubsztrátja, nicknél is emészt, de a tioészter kötéseket nem hasítja! - 3’ foszfatáz: ss/ds DNS lehet a szubsztrátja, de a láncon belüli foszfodiészter kötéseket nem hasítja! → felhasználás: gén előtti szabályzó régiók térképezésére alkalmas, enzimtitrálásos módszerrel: Az enzimet különböző koncetrációkban adjuk hozzá a vizsgálandó gént hordozó DNS darabhoz. Így a DNS darab különböző mértékben emésztődik és eltérő méretű fragmenteket kapunk. A szabályzó régiókat úgy tudjuk vizsgálni, hogy az adott gén szabályzó fehérjéit hozzá adjuk az emésztett fragmentekhez. Mivel ezek DNS kötő fehérjék, ezért ha az emésztés után megmaradt a kötőhelyük akkor odakötnek, ha már megemésztődtek akkor nem. Ezzel az tudjuk vizsgálni, hogy a DNS darabon belül az egyes fehérjék kötőhelyei hol helyezkednek el. BAL 31 nukleáz → aktivitás: - endo és exonukleáz egyben └> az endo és exonukleáz aktivitást keverve használja (gyors exonukleázos emésztést, egy lassabb endonukleázos emésztés követ) - csak exonukleáz: ss/dsDNS-t hasít mindkét végről - csak endonukleáz: ss/dsDNS-t, supercoiled DNS-t valamint B és Z formájú DNS hasít └> nick-eknél és dsRNS-nél is aktív → Ca2+ függő → deléciók létrehozására alkalmas Bakteriofág λ exonukleáz → aktivitás: - 5’ → 3’ aktivitás: ss/dsDNSt-t egyaránt hasít, de a dsDNS-t preferálja → ma már nem használt, régebben széleskörben alkalmazott volt (főleg molekuláris klónozás) DNáz I. → aktivitás: - endonukleáz aktivitás: ss/dsDNS-t hasít főleg pirimidin bázisok mentén - Mg2+ jelenlétében: random hasítás, a szálakat külön-külön más helyeken hasítja - Mn2+ jelenlétében: random hasítás, a két szálat egymással szemben hasítja →felhasználás: - RNS minta DNS mentesítése - nick transzlációnál a ninckek létrehozása - fehérje-DNS komplexek analízise: └>a random hasítás következtében eltérő hosszúságú fragmentek jönnek létre, így egy méretlétrát adnak megfuttatva └> a fehérjét hozzá adjuk az emésztetlen mintához, majd ezt is megemésztjük └> ahol a fehérje beköt ott nem tud hasítani az enzim, így a fehérje által lefedett bázisokhoz tartozó fragmentek hiányoznak a méretlétrából, ezáltal pontosan meg tudjuk adni, hogy hány bázistól hány bázisig köt a fehérje 16 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu S1 nukleáz → aktivitás: - ssDNS/RNS-t hasít, DNS-en aktívabb - nick-ek mentén is képes hasítani - működéséhez Zn2+ szükséges → 5x gyorsabb a Mung beannél → felhasználás: S1 mapping → intron méretének meghatározására alkalmas: └> mRNS-hez az azt kódoló génszakasznak megfelelő jelölt DNS próbát hibridizálunk └> az mRNS-ben már nincs benne az intron szekvencia (érett mRNS), ezért a DNS-en az intron hurkot képez └> S1 nukleázt hozzáadva a hurkok leemésztődnek, így egy emésztett próbát és egy teljes hosszúságú mRNS-t kapunk └> ezeket megfuttatva, a teljes hosszúságú próba mellett, a méretkülönbségből az intron méretét meghatározhatjuk transzkripció iniciáció meghatározása: └> mRNS-t tisztítunk, jelölt DNS próbával hibridizáljuk └> S1-el emésztve az egyszálú nukleinsavak leemésztődnek └> teljes hosszúságú próba mellett futtatva a transzkripciós iniciációs pontra következtethetünk Mung bean nukleáz → aktivitás: - 5’ → 3’ exonukleáz : ssDNS-t emészt mono- és oligonukleotidokra → felhasználás: túlnyúló végek visszaemésztése tompa véggé RNáz A → aktivitás: - pirimidin bázisok mentén hasít ssRNS-t → felhasználás: nem hibridizált RNS eltávolítása DNS-RNS hibridekről RNáz T1 → aktivitás: - guanin mellett hasít ssRNS-t → felhasználás: nem hibridizált RNS eltávolítása DNS-RNS hibridekről 17 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 4. tétel Vektorfajták és jellemzésük Vektorok: → kívánt nukleinsav szekvencia sejtbe történő bejuttatását teszik lehetővé („hordozó anyagok”) → felhasználás: klónozás, fehérje termeltetés, genetikai manipulációk stb… Klónozásban általánosan használt vektortípusok Típus Plazmidok Fonalas fágok Fagemidek λ fágok kozmidok BAC, YAC Példa pUC18, 19 mp18, 19 pBluescriptKS, SK± EMBL3, 4 pHC79 pBAC108L, pYAC3 Inszert mérete 10-15 kb 5-10 kb 10-15 kb 20-25 kb 35-45 kb 150- 300 kb Plazmidok → cirkuláris kettős szálú DNS molekulák → bejutás után a sejtben fennmaradnak, ott önállóan replikálódnak → tartalmaznak: └> egy replikációs origót └> multicloning site-ot (egyedi restrikciós endonukleázok hasító helyeinek halmaza) → ide lehet klónozni └> antibiotikum rezisztencia géneket → szelekciót tesz lehetővé → átlagos inszertméret: 10-15 kb → pl.: F (fertilitási) faktor, különböző rezisztencia faktorok (R) Fonalas fágok → pl.: M13, f1 és fd fágok → genomjuk 98%-ban azonos  rekombinálódhatnak egymással → az érett fágok genomja egyszálú cirkuláris DNS └> a sejten belül: RF (replikatív forma)  ez alkalmas a genetikai manipulációkra → a fonalas fágok genomjának 90%-a 10 fehérjét kódol └> 2 nagyobb intergenikus régió található a VIII és a III gének illetve II és IV gének között, amelyek regulátor funkciót töltenek be 18 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu → a VIII fehérje a fő strukúr protein, 2700 kópiában található meg a fonalas fágokban → szintén jelentős a III számú fehérje → a filament végén található meg néhány kópiában → a fonalas fágok a szexpiluson (F) keresztül fertőznek, a (+) DNS szál jut be a sejtbe → ebből alakul ki a kétszálú replikatív forma = RF (15-20 perc alatt 100-200 kópia keletkezik) → replikáció: └> II fehérje töréspontot idéz elő, DNS polimeráz I polimerizál └> WC papír modell : a II. fehérje vagdossa egységnyi darabokra a DNS-t └> V fehérje: egyszálú DNS kötő fehérje, represszálja a II gén expresszióját  kópiaszám kontroll →az RF forma képződése után, transzkripció és transzláció megy végbe → nem ölik meg a gazdasejtet, csak lassítják a növekedését → nem teljes tarfolt → régebben dsDNS szekvenálásra használták: └> a szekvenálni kívánt DNS darabot bejuttatták a fágba, majd baktérium sejteket fertőztek vele └> mivel az érett fág ssDNS-t tartalmaz, ezért az könnyen elkülöníthető a dsDNS-től, így a felszaporítás után kivonták a dsDNS-t és megszekvenálták (ma már PCR-al szaporítanak ) A fonalas fágok életciklusa → a fág nem a sejten belül szerelődik össze, hanem az ssDNS - V fehérje komplex a membránhoz vándorol és a membránon keresztüljutva beburkolódik a kapszid fehérjékbe → vektorként való alkalmazása (mára már elavult): └> 500 bp a II és IV gének között nem kidobható, mivel ezek a (+) és (-) szál szintézisének iniciációját és terminációját befolyásolják! └> nincs szoros mérethatára a pakolódásnak (egyébként 5-10 kb) └> pozitív klónok kimutatása: LacZ  komplementációval (nincs antibiotikum rezisztencia génje) └> hátrányuk: mini replikon képződése → egyéb felhasználásuk: epitóp könyvtárak készítése 19 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Epitóp könyvtár készítése, fág display vektorok → epitóp: a vírus-köpenyfehérjéjének azt a minimum 5–7 aminosavból álló szakaszát, amely az antitesttel kapcsolatba lép, epitópnak nevezzük → rekombináns DNS technikával epitóp könyvtárat hozunk létre, ahol minden egyes fág más-más egyedi epitópot hordoz → fág display: a fágok felületén történő "bemutatás" └> az azonosítani kívánt fehérjét/peptidet (esetünkben epitópot) felkötjük egy oszlopra └> majd affinitás kromatográfiát végzünk, sokféle epitópot tartalmazó fágok alkalmazásával └> a specifikus kötődést követően screenelést végzünk az epitóp könyvtárunkban és beazonosítjuk az epitópunkat =>példa: anthrax toxin inhibitor tervezése, monoklonális ellenanyagok előállítása Fagemidek → fágok és plazmidok hibridjei → nincs mini replikon kilépés (előny a fonalas fágokkal szemben!) → tartalmaz: └> fág replikációs origót └> bakteriális replikációs origót └> antibiotikum rezisztencia gént └> multi cloning site-ot (MCS) └>LacZ-gént → helper fág nélkül plazmidként szaporodik; helper fággal felülfertőzve: burokfehérjébe pakolva, fertőzőképes fágként lép ki a sejtből és tovább fertőz → példa: pBluescript II SK vagy KS (+/-) └> a +/- a fág replikációs origó orientáltságától függ └> az SK vagy a KS a KpnI és SacI restrikciós endonukleázok MCS-on belüli helyzetétől függ 20 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu λ fágok bal kar 20 kb EcoRI BamHI SalI centrális régió 14 kb jobb kar 9 kb co co EcoRI BamHI SalI → olyan mérsékelt bakteriofág, amely az E. coli baktérium sejtjeit fertőzi meg → a fágrészecske egy 64 nm átmérőjű ikozaéder fejből, és egy 150 nm hosszúságú farokból áll → a fejben található a fág 40-50 kb nagyságú kettős szálú, lineáris DNS-e →két életciklus: └> lizogén: a fág genetikai anyaga beépül a kromoszómába (profág), a sejt túlél └> lítikus: érett fág képződése során a sejtek lizálnak, elpusztulnak → a DNS-ük két végén ragadós. ún. cos régiók találhatóak a középső, centrális régió eltávolítható bepakolási szabály: vad típusú λ fág méretének 79-105%-a illeszthető be → példák: └> replacement (helyettesítő) vektorok: centrális régió kivágása, majd a kívánt szekvencia beillesztése a jobb és bal kar közé └> inszerciós vektorok: centrális régióba való beépítés A lambda fág életciklusa 21 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Génátvitel transzdukcióval baktériumokban bakteriális DNS-t is tartalmazó, többnyire defektív fágok fág DNS transzdukáló fág intakt normál fág bakteriális fágfertőzés lizogén életciklus fág genom integrálódása a baktérium kromoszómájába a fág által hordozott bakteriális DNS beépülése rekombinációval Cosmidok → plazmidok és λ fágok hibridjei → fág ként juttathatók be fertőzéssel → nagy hatékonyság → a sejtben plazmid ként viselkedik (replikáció) → praktikus, mert kisméretű és nagy inszert is beilleszthető → a cos végek a bepakolódást szolgálják, in vitro kémcsőben fertőző képes fágok készíthetők! → rendelkezik rezisztencia génekkel: szelekció biztosítása Mesterséges kromoszómák 1. BAC (Bacterial artificial chromosome) → akár 300 kb méretű inszert is belehelyezhető, de alacsony kópiaszám (1-2 kópia/sejt) → könnyű tisztítani → az F faktorból vezették le → kis transzformációs hatékonyság (elektroporációval javítható) 2. YAC (Yeast artificial chromosome) → replikáció szempontjából fontos szekvenciák: TEL, CEN4, ARS → rekombinánsok kiválasztása szempontjából fontos szekvenciák: TRP1, URA3, SUP4 → Saccharomyces cervisiae-ben szaporítják 22 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 5. tétel Vektorok sejtbe juttatásának módjai I. Kémiai transzformálás *kompetens sejt: a DNS felvételére alkalmassá tett sejt → a sejteket felnövesztés után centrifugáljuk → majd speciális kétértékű kationokat (Ca2+, Mn2+) tartalmazó oldattal kezeljük őket → végül sejtfal permeabilitást növelő ágenst: DMSO-t (dimetil-szulfoxid) adunk hozzájuk *transzformációs hatékonyság: transzformánsok száma /µg DNS → elvi szám, a transzformációt 1 ng mennyiségű DNS-sel hajtjuk végre! → normál érték: 106 - 108 → nagyon jó: 109 A transzformáció hatékonyságát meghatározó tényezők: - oldatok, edények tisztasága (minél sterilebb, annál jobb) - sejtek növekedési sebessége - növesztési hőmérséklet - pH (semleges közeli érték a legjobb) - hősokk hőmérséklete, hossza (optimum: 30 sec, 40-50oC között) - permeabilizáló ágens százalékos koncentrációja → DMSO (optimum 5-10% között) - vektor mérete (minél kisebb annál jobb) A lineáris DNS transzformációs gyakorisága kb. 2 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a cirkuláris DNS-é! II. Elektroporáció → a sejteket felnövesztés után kis vezetőképességű, nagy ellenállású ( 600 ), glicerines pufferben szuszpendáljuk → majd nagyfeszültségű impulzust adunk rájuk kb. 5 ms-ig => a transzformációs hatékonyság 20 - 50 x jobbá válik (1010/µg DNS) → sejttípusonként optimalizálni kell! Meghatározó faktorok: - glicerin koncentrációja - az oldat ellenállása - az impulzus nagysága, hossza - permeabilizáló, redox potenciált befolyásoló faktorok adagolása 23 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu III. Konjugáció → sejtből sejtbe történő DNS átadás → lépései: └> párosodás: speciális kontaktus a donor és a recipiens között egy sejtfelszíni ponton keresztül (pilus) └> DNS átjuttatását közvetítő folyamatok, replikcáció (rolling circle modell), az egyik szál átjutása → tra gének: └> a kromoszómába integráltan helyezkednek el └> transzfert kódoló géncsoport, amelynek a pilus képzésben és a konjugációban van szerepe └> TraA: a pílus létrehozásáért felelős tra gén, csak konjugációra képes baktériumok hordozzák → oriT régió:a transzfer kezdőpontját képezi (origin of transfer) → 3 típus: A, recipiensből donort csinál └> pl.: szex faktor (F episzóma) B, a recipiensből nem lesz donor └> pl.: IncP csoportba tartozó: RP4, RK2 plazmidok (szilárd fázishoz mobilizálható plazmidok) └> a plazmid tartalmazza a DNS processzáló apparátust (oriT, mob region), de nem tartalmazza a tra géneket C, háromkomponensű konjugáció: └> sem a donor sejt sem a recipiens nem tartalmazza a transzferhez szükséges géneket (tra gének) → egy harmadik sejt működik közre (helper sejt) A DNS transzfer mechanizmusa a konjugáció során donor recipiens 5’ donor recipiens TraI 5 ’ Töréspont, nick donor TraI recipiens Egyszálú DNS kötő fehérje TraC primáz 5’ RNS primer Replikatív DNS polimeráz TraI 24 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu A konjugáció mechanizmusa 25 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu IV. Egyéb praktikák: - spheroplast készítés ozmotikum jelenlétében, majd ezt transzformáljuk - a DNS-t liposzómába csomagoljuk transzfomálás előtt Vektor önligálását, üres vektorok képződését gátló módszerek - kondicionálisan letális gének használata - korrekt vektor/inszert arány megválasztása - vektor defoszforilálása ↓ a ligáz csak 5’ foszfát – 3’ OH végeket tud összekapcsolni, ha a vektort defoszforiláljuk, nem tud önligálódni 26 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 6. tétel Genomi és cDNS könyvtárak jellemzése, készítése Könyvtárak típusai Követelmények a könyvtárakkal szemben - fedje le a teljes genomot, illetve mRNS populációt - ne legyen redundáns (ne legyen ismétlődő) 1. genomiális könyvtár: → a teljes genomból készül, minden információt tartalmaz (nem transzlálódó régió, szabályozó régiók, intronok) → mind prokariótákból, mind eukariótákból készíthető Genomiális könyvtár készítésének sémája: - λ fág genom emésztése: centrális régió kivágása (jobb és bal kar megmarad) - a genom emésztése (teljes vagy részleges) 20-24kbp-os fragmentekre → ligálás a jobb és bal kar közé (in vitro pakolás kémcsőben: fág fehérje extraktummal történő automatikus - sejtek fertőzése majd szélesztés - tesztelés, (antibiotikum rezisztencia stb). 27 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu - cosmidokban is hasonlóan működik csak itt nem a centrális régiót vágjuk ki, hanem megemésztjük a MCS-ben lévő valamely restrikciós helynek megfelelő enzimmel → cirkuláris forma felnyitása lineárissá - genom emésztése, kompatibilis véget adó enzimmel, majd összeligálás - in vitro pakolás, fertőzés, végül antibiotikum rezisztenciára tesztelés Részleges genomi könyvtár készítése: - a DNS két vége A , B ill. C,D restrikciós helyeknek felelnek meg - szerencsés esetben ezek nem fednek át 28 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 2. cDNS könyvtár: → az aktívan termelődő mRNS-ekből készül → csak az érett mRNS szekvenciáját tartalmazza (nincs intron régió stb..) → csak eukariótákból készíthető => ha izoláljuk egy adott sejttípusban megtalálható összes mRNS-t, majd ezekről reverz transzkriptáz segítségével komplementáris DNS-t (cDNS) készítünk és az összes cDNS-t plazmidba vagy fágba klónozzuk, akkor cDNS könyvtárhoz jutunk *expressziós cDNS könyvtár: a cDNS-eket ún. expressziós kazettába klónozzuk, ezáltal ha az mRNS kódol fehérjét, az aktívan termelődhet cDNS könyvtár mRNS-ekkel szemben támasztott követelményei: INTEGRITÁS! → az mRNS mérete ill. hogy degradált-e └> válasz: denaturáló gélelektroforézis (várt méret 0.5 - 8 kb, a többség 1.5 -2 kb) → lehet-e teljes hosszúságú cDNS-t szintetizáltatni róla? └> válasz: előzetes reverz transzkripció jelölt nukloetidokkal majd gélelektroforézis → lehet-e nagy molekulasúlyú fehérjéket in vitro szintetizálni vele? └> válasz: in vitro transzláció jelölt aminosavakkal → a kérdéseses fehérjét tudjuk-e szintetizáltatni vele? └> válasz: in vitro transzláció + immunoprecipitáció → a kérdéses mRNS előfordulási gyakorisága └> az emlőssejtekben 10000 - 30000 különböző mRNS található └> nagy gyakoriságú pl.: globin (50-90%) → nem problematikus └> kis gyakoriságú (<0,5%) → nagy könyvtárat kell készíteni, és a detektálás is gond N ln(1  P) 1 LN (1  ) n ahol: N: a szükséges klónok száma a könyvtárban P: annak a valószínűsége, hogy a keresett klón benne legyen a könyvtárban 1/n: az az mRNS frakció, ami 1 db keresett mRNS-t tartalmaz Pl.: 14 molekula/sejt,  1/n = 37000, P= 0.99, N= 170000 =>megoldás: dúsítás ( 1% alatt célszerű) Dúsítás lehetséges kivitelezései: → mRNS méret szerinti elválasztása: - elektroforetikus úton - sucrose  grádiensen └>minden frakciót tesztelni kell immunoprecipitációval → cDNS méret szerinti elválasztása (könnyebb, pontosabb) → poliszómák immunoprecipitációja (technikailag nehéz, és csak megbízható források esetén működik) 29 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu cDNS könyvtárkészítési módszerek: 1. mRNS tisztítása 2. az mRNS-t oligodT primerhez hibridizáljuk 3.reveztranszkriptáz és dNTP felhasználásával komplementer DNS szál szintézise az mRNSről 4. mRNS alkalikus degradációja 5. 5’ vég visszahajlása és hurokképződés 6. az önkomplementer szakaszok hibridizációja → primerként szolgál a másik szál szintéziséhez 7. Klenow polimeráz és dNTP felhasználásával másik szál megszintetizálása 8. S1 nukleázos emésztés (a hurok eltávolítása) 9. tompa végű dsDNS-t kapunk, amit tudunk tovább klónozni 30 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu cDNS-könyvtár készítése primer adapter módszerrel  mRNS degradációja     Adapterek → szintetikus kettősszálú oligonukleotidok, melyek végei kompatibilisek, különböző restrikciós endonukleázokkal végzett emésztések során képződő végekkel → esetenként valamilyen restrikciós endonukleáz felismerőhelyét tartalmazhatják Primerek → szintetikus oligodezoxinukleotidok, amelyek iniciációs pontként szolgálnak a templát függő DNS polimerázok számára → univerzális primerek: a gyakorlatban elterjedt vektorok klónozó helyének környékére tervezett primerek → specifikus primerek: az adott feladatnak megfelelően szintetizált, speciális szekvenciájú oligonukleotidok A primer-adapter módszer lényege: → restrikciós endonukleáz hasítóhelyet szerkesztünk a cDNS-ünk két végére, mégpedig úgy, hogy homopolimert (az ábrán CTP) illesztünk a 3’ végre, terminális transzferáz felhasználásával → ez azért szükséges, hogy ide lehessen illeszteni az adaptert → majd Klenow polimeráz és dNTP alkalmazásával megszintetizáljuk a másik szálat → hasítunk azzal az enzimmel (esetünkben SalI), amely kompatibilis az adapterrel → klónozás, ugyanazzal a restrikciós enzimmel hasított vektorba 31 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 32 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu Linkerek → rövid, önkomplemeter oligonukleotidok, amelyek saját magukhoz hibridizálva, olyan tompa végű, kettősszálú DNS-t képeznek, amely tartalmazza egy tetszőleges restrikciós endonukleáz felismerő helyét → restrikciós hely bevitelére alkalmas BamHI EcoRI PstI CGGATCCG GGAATTCC .GCTGCAGC 33 A dokumentum bármely részének, bármilyen módszerrel, technikával történő másolása és terjesztése tilos! © www.whyz.hu 7. tétel Pozitív klónok kiválasztására szolgáló módszerek. Élesztő és bakteriális két hibrid rendszer Inszertet tartalmazó klónok kiválasztása 1. antibiotikum rezisztencia alapján: └> két antibiotikum rezisztencia gén szükséges, az egyik elromlik, ha inszert épül be └>fáradtságos szurkálások (Rákhely lusta ) 2. kolónia hibridizáció, univerzális mindig használható 1. vizsgálandó kultúra izolálása agaron 2. kolóniatranszfer ni